胡靜榮 (華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

降解亞硝酸鹽優(yōu)勢菌的篩選研究

胡靜榮
(華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

為了篩選出繁殖速度快、降解亞硝酸鹽能力強、經(jīng)濟成本低的優(yōu)勢菌種，取不同河流的淤泥樣本分別放入降解亞硝酸鹽的富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)、分離、純化。結(jié)果篩選出1株降解亞硝酸鹽能力較強的菌，可以在24 h內(nèi)降解養(yǎng)殖水體容納亞硝酸鹽臨界值的500倍。

亞硝酸鹽；優(yōu)勢降解菌；篩選

隨著規(guī)?；⒏呙芏人a(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展及工業(yè)廢水和生活污水的大量排放，生態(tài)環(huán)境遭到破壞，嚴重影響了漁業(yè)的發(fā)展[1]。據(jù)報道，養(yǎng)殖水體中容納亞硝酸鹽臨界值為0.2 mg/L，在0.5 mg/L時會引起魚類死亡或患病，高于0.8 mg/L會引起大批死亡；河蟹、對蝦育苗水質(zhì)的亞硝酸鹽氮應(yīng)控制在0.1 mg/L以下，在0.3 mg/L時輕度死亡，超過0.5 mg/L將引起大量死亡[2]。為了解決水體亞硝酸鹽含量超標導(dǎo)致魚蝦死亡問題，國內(nèi)外科研工作者做了大量工作。傳統(tǒng)使用抗生素和其他化學(xué)藥物降解亞硝酸鹽的方法不僅收效甚微，而且還引發(fā)了一系列環(huán)境和社會問題。近年來，人們開始嘗試在養(yǎng)殖水體中使用微生物制劑來改善養(yǎng)殖水體的生態(tài)環(huán)境，從而降低亞硝酸鹽的含量，如硝化細菌、枯草芽孢桿菌等[3，4]在許多國家已經(jīng)取得了顯著成效。本研究通過定向篩選、富集培養(yǎng)，以期從淤泥中篩選出繁殖速度快、降解亞硝酸鹽能力強、經(jīng)濟成本低的優(yōu)勢菌種，以期為生產(chǎn)工業(yè)提供優(yōu)質(zhì)材料。

1 材料與方法

1.1 材料

(1)淤泥樣品 來源于湖北省荊州市古城護城河周邊的污水渠和魚塘。

(2)培養(yǎng)基 亞硝酸鹽液體培養(yǎng)基制作方法：將NaNO20.1 g、NaCl 0.5 g、K2HPO40.5 g、MgSO40.5 g、葡萄糖 0.2 g、鐵鹽母液0.1 mL(亞鐵鹽母液：0.557 g FeSO4，0.745 g EDTA-Na2，加蒸餾水定容至10 mL)加蒸餾水定容至1 L，調(diào)pH為7.2，滅菌待用。在液體培養(yǎng)基中加入7 g瓊脂粉，定容至1 L，制成固定培養(yǎng)基，滅菌待用。

1.2 方法

(1)富集培養(yǎng) 將淤泥樣品分別放于裝有100 mL亞硝酸鹽液體培養(yǎng)基中，在37 ℃、170 r/min的恒溫搖床上預(yù)備培養(yǎng)，每天檢測預(yù)備培養(yǎng)液中亞硝酸鹽的降解情況。從已降解完畢的預(yù)備培養(yǎng)液中對應(yīng)取出1 mL菌液轉(zhuǎn)入100 mL亞硝酸鹽液體培養(yǎng)基中進行“第一次培養(yǎng)”，48 h后進行檢測。依次類推，進行“第二次培養(yǎng)”、“第三次培養(yǎng)”，共6次培養(yǎng)，使其降解亞硝酸鹽的能力穩(wěn)定并逐漸純化獲得更多的優(yōu)勢菌。

本研究采用重氮化偶合法檢測亞硝酸鹽[5，6]，自定義Q表示每次繼代培養(yǎng)48 h，單位體積的菌量降解單位體積培養(yǎng)基中亞硝酸鹽的能力。

式中，DC0表示未接菌培養(yǎng)基的光密度值；DCi表示接菌48 h后培養(yǎng)基的光密度值；M表示接入的菌液量(mL)；N表示培養(yǎng)基的體積(mL)。若P值越大，表示降解能力越強，降解亞硝酸鹽優(yōu)勢菌純度越高；P值越小，表示降解能力越弱，降解亞硝酸鹽優(yōu)勢菌純度越低。

(2)菌的純化 取第六次培養(yǎng)后的菌液5 μL，用無菌水稀釋至200 mL后均勻地涂抹在亞硝酸鹽固體培養(yǎng)基平板上，置于37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h，選取生長較大的菌落進行劃線培養(yǎng)，每個菌落2次重復(fù)劃平板，置于 37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中24 h。重復(fù)中一平板采用重氮化偶合反應(yīng)法進行染色，觀察顯色反應(yīng)，若顯示無色表明亞硝酸鹽完全降解，再對應(yīng)從重復(fù)中另一平板上挑選相應(yīng)菌落進行液體培養(yǎng)，并保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件對所得數(shù)據(jù)進行分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)勢菌的富集培養(yǎng)

通過富集培養(yǎng)，篩選出2個降解亞硝酸鹽效果理想的混合菌群，分別命名為“一號菌群”和“二號菌群”。從預(yù)備培養(yǎng)液中分別取1 mL接入新的培養(yǎng)基進行“第一次培養(yǎng)”，依次類推進行“第二次培養(yǎng)”、“第三次培養(yǎng)”直到“第六次培養(yǎng)”，結(jié)果均是“二號菌群”的降解能力強于“一號菌群”，并且隨著繼代培養(yǎng)次數(shù)的增加，“二號菌群”的降解能力越強(圖1)。此外，隨著培養(yǎng)次數(shù)的增加，2個菌群降解亞硝酸鹽的能力均增強，且經(jīng)“第五次培養(yǎng)”后降解能力急劇上升。

圖1 菌群的培養(yǎng)次數(shù)與降解亞硝酸鹽能力的關(guān)系Figure 1 The relationship between subculture times of colonies and the ability of nitrite degradation

從“第六次培養(yǎng)”后的2個菌群中分別取出等體積的菌液進行混合培養(yǎng)，命名為“三號菌群”，目的是研究“一號菌群”與“二號菌群”之間是否存在增效或拮抗作用。結(jié)果表明：“二號菌群”效果最好，其次是“三號菌群”，“一號菌群”效果最差，由此說明“一號菌群”與“二號菌群”之間并無增效作用。

2.2 優(yōu)勢菌的純化

將“三號菌群”涂平板，挑選長勢良好的菌落劃線培養(yǎng)并染色(圖2)，將顯無色的1株菌G置于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，取5 μL菌液用無菌水稀釋至200 μL后均勻地涂抹在平板上，培養(yǎng)24 h后染色，可見整個平板顯無色，表明菌落純度高、降解亞硝酸鹽能力強(圖3)。

3 討論與小結(jié)

目前降解亞硝酸鹽的常見方法有化學(xué)法、物理法與微生物分解法3大類?；瘜W(xué)方法有氧化還原法，如二氧化氯、高鐵酸鹽等；物理方法有吸附法如沸石粉、活性炭等。但由于所用化學(xué)產(chǎn)品(或吸附產(chǎn)品)維持時間短，容易反彈，控制不好且容易污染環(huán)境。所以這兩類方法無法解決根本問題。

圖2 菌落劃線培養(yǎng)后顯色圖Figure2 Colonydyeingmapafterstreakculturing圖3 優(yōu)勢菌繼代培養(yǎng)后顯色圖Figure3 Dyeingmapofpredominantstrainaftersubculture

本研究從淤泥中篩選分離出1株可以在24 h內(nèi)降解養(yǎng)殖水體容納亞硝酸鹽臨界值的500倍的菌，為生產(chǎn)工業(yè)提供了優(yōu)質(zhì)菌種材料。

[1]吳 偉.應(yīng)用復(fù)合微生物制劑控制養(yǎng)殖水體水質(zhì)因子初探[J].湛江海洋大學(xué)學(xué)報，1997，17(1):17～20.

[2]凌 歌.一種亞硝酸鹽降解新方案及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用[J].漁業(yè)致富指南,2010,(12):27.

[3]仇 麗,凌愛珍,祝井愛.枯草芽孢桿菌制劑改良中華絨蟹人工育苗水質(zhì)的試驗[J].中國水產(chǎn),2001,(4):82.

[4]韓繼宏,阮宜兵,黃志誠.枯草芽孢桿菌及其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用[J].漁業(yè)致富指南,2002,(22):52.

[5]Ali A Ensafi，Kazemzadeh A.Monitoring nitrite with optical sensing films[J].Microchemical Journal，2002，72:193～199.

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2010-09-15

胡靜榮(1986-)，女，湖北襄樊人，碩士研究生，研究方向為水生態(tài)環(huán)境保護.

10.3969/j.issn.1673-1409(S).2010.04.017

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1673-1409(2010)04-S059-03