張海元，許光華，張 靜

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

MS-275增強(qiáng)順鉑致肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)的實(shí)驗(yàn)研究

張海元，許光華，張 靜

(長江大學(xué)醫(yī)學(xué)院，湖北 荊州 434023)

目的：探討MS-275與化療藥物順鉑(cisplatin,DDP)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞系HLE增殖的抑制效果。方法：通過MS-275聯(lián)合化療藥物順鉑處理培養(yǎng)的肝癌細(xì)胞系HLE，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)(MTT)法檢測細(xì)胞增殖抑制率，流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測細(xì)胞周期和凋亡率。結(jié)果：MTT結(jié)果顯示：0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯(lián)合應(yīng)用后5d，HLE細(xì)胞增殖抑制率達(dá)(97.86±5.62)%，明顯高于單用MS-275組的(51.75±2.31)%和DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示：MS-275與DDP聯(lián)合應(yīng)用明顯導(dǎo)致細(xì)胞S期減少，G2/M期阻滯；MS-275聯(lián)合DDP組細(xì)胞凋亡率為(17.46±2.57)%，明顯高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。結(jié)論：MS-275與DDP聯(lián)合應(yīng)用能顯著提高對(duì)肝癌細(xì)胞系HLE增殖的抑制作用。

肝癌；細(xì)胞系；MS-275；順鉑；基因治療

順鉑(cisplatin，DDP)是臨床應(yīng)用最為廣泛的一種抗腫瘤藥物。鉑類藥物的主要作用機(jī)制是通過損傷DNA, 使細(xì)胞進(jìn)入G1期生長抑制，并誘導(dǎo)損傷嚴(yán)重的細(xì)胞進(jìn)入凋亡狀態(tài)[1]。但順鉑副作用較大，順鉑用量增大容易引起骨髓抑制及腎功能嚴(yán)重?fù)p害，另外順鉑使用劑量趨近于亞致死劑量時(shí)易引起耐藥性，故使得順鉑應(yīng)用于肝細(xì)胞癌的治療效果并不理想。MS-275屬于苯甲酰胺類HDACs抑制劑，可上調(diào)p21基因的表達(dá)，對(duì)多個(gè)小鼠的人腫瘤模型都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑瘤作用[2]，但將MS-275和化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用于肝癌細(xì)胞國內(nèi)外尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬采用低劑量的順鉑和MS-275聯(lián)合應(yīng)用，以探討其是否具有協(xié)同作用，從而減少肝癌患者順鉑的使用劑量，減少順鉑的毒副作用，增強(qiáng)患者的耐受性。通過本項(xiàng)目中MS-275與順鉑聯(lián)合應(yīng)用對(duì)肝癌細(xì)胞系HLE影響的效果及機(jī)制的探討，有望獲得全新的聯(lián)合抗肝癌的藥物治療方案。

1 材料與方法

1.1材料肝癌細(xì)胞系HLE由新加坡國立大學(xué)腫瘤研究所饋贈(zèng)，細(xì)胞接種于含10%新鮮牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中傳代培養(yǎng)，RPMI1640培養(yǎng)液及二甲亞砜(DMSO)購自美國GIBCO公司。DDP購于錦州九泰藥業(yè)公司,MS-275購自德國Merck公司。

1.2方法

1.2.1 HLE細(xì)胞培養(yǎng) 將肝癌細(xì)胞系HLE接種于含10%新生牛血清和抗生素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于5% CO2及飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。利用0.125%的胰蛋白酶消化傳代，1～2d換液一次。

1.2.2 體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)法(MTT)檢測肝癌細(xì)胞系HLE的增殖情況 將細(xì)胞接種于96孔板，設(shè)對(duì)照組、MS-275(0.5μmol/L)組、DDP(6.25μg/ml)組及MS-275+DDP聯(lián)合治療組，每孔加入MTT液20μl，于37℃ CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄培養(yǎng)液，各孔加200μl二甲基亞楓，用酶聯(lián)儀在570nm波長下檢測每孔的光密度(D)，每組重復(fù)3板，計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

細(xì)胞生長抑制率(%)=[(1-實(shí)驗(yàn)組D值)/對(duì)照組D值]×100%。

1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測肝癌細(xì)胞系HLE的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況 HLE細(xì)胞經(jīng)單純加入

DDP(6.25μg/ml)或MS-275(0.5μmol/L)及MS-275與DDP聯(lián)合應(yīng)用,48h后收集所有貼壁和懸浮細(xì)胞，用10mmol/L PBS(pH7.4)洗滌兩次，通過流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況。

2 結(jié) 果

2.1各組藥物對(duì)肝癌細(xì)胞系HLE的生長抑制率檢測結(jié)果顯示，0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯(lián)合應(yīng)用120h后，HLE細(xì)胞增殖抑制率達(dá)(97.86±5.62)%，明顯高于僅用MS-275組的(51.75±2.31)%及DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)。見表1。

表1 各組藥物對(duì)HLE細(xì)胞增殖的抑制作用 %

注：MS-275+DDP組與MS-275組或DDP組比較，均Plt;0.05。

2.2流式細(xì)胞術(shù)檢測HLE細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡率0.5μmol/L MS-275可導(dǎo)致HLE細(xì)胞S期減少、G2/M期阻滯，而MS-275與6.25μg/ml DDP聯(lián)用后，對(duì)HLE細(xì)胞的S期減少、G2/M期阻滯更明顯。當(dāng)0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯(lián)用60h后，HLE細(xì)胞凋亡率達(dá)(17.46±2.57)%，明顯高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)。見表2。

表2各組藥物對(duì)HLE細(xì)胞周期及凋亡的影響%

組 別G0/G1SG2/M凋亡率對(duì)照組5131±2893285±2471052±147091±026MS?275組6138±2551336±0871928±135762±059DDP組6278±3632139±175951±166736±047MS?275+DDP組5642±351483±2713142±2541746±257

注：MS-275+DDP組與MS-275組或DDP組比較，均Plt;0.05。

3 討 論

肝細(xì)胞癌是常見的消化道惡性腫瘤，其發(fā)生是一個(gè)多因素、多階段、多基因變異的積累過程。肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展不僅存在細(xì)胞增殖與分化的異常，也與細(xì)胞凋亡異常、Runx3 基因啟動(dòng)子區(qū)域異常甲基化密切相關(guān)[3-4]。MS-275是一種較新的苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑(HDACIs)，有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞增殖阻滯、分化和凋亡以及選擇性地作用于腫瘤細(xì)胞等抗癌活性。據(jù)報(bào)道[5-6]，MS-275已被證實(shí)對(duì)白血病和實(shí)體瘤表現(xiàn)出良好的療效，不良反應(yīng)的發(fā)生率極低，發(fā)生程度亦較輕，說明與傳統(tǒng)的化療藥物相比，MS-275具有較大的優(yōu)勢。本課題組在前期的實(shí)驗(yàn)中證明MS-275在肝癌細(xì)胞系Hep3B中能誘導(dǎo)p21WAF1/CIP1表達(dá)，加速腫瘤細(xì)胞凋亡[7]，并對(duì)多個(gè)小鼠的人腫瘤模型上都表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑瘤作用。Sato等[8]應(yīng)用MS-275聯(lián)合順鉑治療口腔鱗狀細(xì)胞癌，證實(shí)兩類藥物可通過不同途徑作用于腫瘤細(xì)胞，具有協(xié)同作用，對(duì)化療藥物起到減毒增效的功效。

本實(shí)驗(yàn)通過MTT和FCM檢測到了MS-275與化療藥物DDP單用或聯(lián)合應(yīng)用時(shí)對(duì)肝癌細(xì)胞系HLE增殖的抑制作用。MTT檢查結(jié)果顯示，0.5μmol/L MS-275與6.25μg/ml DDP聯(lián)合應(yīng)用后5d，HLE細(xì)胞增殖抑制率達(dá)(97.86±5.62)%，顯著高于單用MS-275組的(51.75±2.31)%和DDP組的(43.48±2.39)%(Plt;0.05)，說明苯酰胺類組蛋白去乙酰酶抑制劑MS-275與低劑量化療藥物順鉑聯(lián)合應(yīng)用后，能明顯誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖抑制。FCM結(jié)果顯示，MS-275與DDP聯(lián)合應(yīng)用明顯導(dǎo)致細(xì)胞S期減少，G2/M期阻滯；MS-275聯(lián)合DDP組細(xì)胞凋亡率為(17.46±2.57)%，顯著高于單用MS-275組的(7.62±0.59)%和DDP組的(7.36±0.47)%(Plt;0.05)，說明MS-275與順鉑聯(lián)合應(yīng)用，可能通過上調(diào)p21基因表達(dá)，阻止腫瘤細(xì)胞進(jìn)入S期，使其停滯于G1期，同時(shí)發(fā)生G2/M期阻滯，腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯增強(qiáng)。由本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測，MS-275與DDP聯(lián)合應(yīng)用時(shí)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制可能與細(xì)胞周期阻滯及上調(diào)凋亡作用有關(guān)。因此，MS-275與化療藥物DDP在肝細(xì)胞癌的治療上有一定的互補(bǔ)作用，能提高肝細(xì)胞癌的療效，并通過降低化療藥物的用量，從而減少其毒副作用及耐藥性。

組蛋白去乙?；敢种苿?HDACIs)類藥物和化療藥物合用已經(jīng)成為最近腫瘤治療界的研究熱點(diǎn)，該研究的方向是通過HDACIs類藥物增加腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物順鉑的敏感性起到增效的目的。通過本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MS-275與順鉑聯(lián)合應(yīng)用明顯優(yōu)于單獨(dú)用藥組，其作用機(jī)制除了通過增強(qiáng)促進(jìn)HLE細(xì)胞周期阻滯和凋亡作用外，可能還與HDACIs類藥物本身特性有關(guān)。HDACIs類藥物能導(dǎo)致組蛋白乙酰化，使染色質(zhì)處在一種開放的構(gòu)象上，會(huì)促使順鉑等以DNA為作用靶點(diǎn)的化療藥物更易接近核小體之間的DNA連接區(qū)，從而更易發(fā)揮作用[9]。本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合應(yīng)用MS-275及化療藥物順鉑處理肝癌細(xì)胞，為肝細(xì)胞癌的治療提供了新的靶點(diǎn)和全新的聯(lián)合用藥方案。

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[編輯] 一 凡

2010-08-29

大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(國家級(jí))(091048930)

張海元(1974-)，男，湖北鄂州人，講師，碩士，從事腫瘤分子生物學(xué)教學(xué)與研究工作。

10.3969/j.issn.1673-1409(R).2010.04.001

R735.7

A

1673-1409(2010)04-R001-03