于鐘 黃開(kāi)紅 王凌云 朱兆華 陳汝福 張晉昕

·論著·

血卟啉衍生物光動(dòng)力治療人胰腺癌細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究

于鐘 黃開(kāi)紅 王凌云 朱兆華 陳汝福 張晉昕

目的研究血卟啉衍生物光動(dòng)力治療(photodynamic therapy, PDT)對(duì)體外培養(yǎng)的人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1的殺傷效應(yīng)及其規(guī)律。方法以Biolitec PDT 630半導(dǎo)體激光治療儀為光源，用不同濃度的血卟啉衍生物Photosan(0.5、1、2、4 mg/L)作為光敏劑孵育PANC1細(xì)胞8 h后，分別給予不同劑量(1、5、10 J/cm2)630 nm激光照射，用MTT法測(cè)定PDT后各組的A492值，以流式細(xì)胞儀測(cè)定10 J/cm2光照后細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果不加光敏劑Photosan或不進(jìn)行光照，對(duì)細(xì)胞均無(wú)殺傷效應(yīng)；添加1 mg/L Photosan時(shí)，10 J/cm2的光照對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)(0.140±0.013對(duì)0.213±0.008，P<0.05)；添加2 mg/L Photosan時(shí)，5 J/cm2和10 J/cm2的光照對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生殺傷效應(yīng)(0.081±0.024和0.049±0.013對(duì)0.211±0.031，P<0.05和P<0.01)；添加4 mg/L Photosan時(shí)，所有光照劑量均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)。但5 J/cm2與10 J/cm2光照對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)無(wú)顯著差異。用10 J/cm2光照，0、2、4 mg/L Photosan時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論單純給予光敏劑或光照對(duì)PANC1均不產(chǎn)生PDT效應(yīng)。光敏劑達(dá)到一定濃度，光照達(dá)到一定劑量后，PDT效應(yīng)隨其增加而增強(qiáng)。

胰腺腫瘤； 光動(dòng)力療法； 血卟啉衍生物； 細(xì)胞系

光動(dòng)力治療(photodynamic therapy，PDT)是利用光敏劑在特定波長(zhǎng)激光照射下產(chǎn)生的光化學(xué)反應(yīng)治療腫瘤的新技術(shù)[1-2]。目前臨床主要限于體表、呼吸道和消化道腔內(nèi)腫瘤的治療。近年來(lái)由于內(nèi)鏡和超聲技術(shù)的進(jìn)步使PDT治療深部臟器腫瘤成為可能。本實(shí)驗(yàn)以人胰腺癌細(xì)胞系PANC1為對(duì)象,應(yīng)用血卟啉衍生物光敏劑，觀察PDT對(duì)其的殺傷效應(yīng)，并初步探討其機(jī)制。

材料與方法

一、MTT 法測(cè)定細(xì)胞的存活

人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1由中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院凍存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取4×103個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)液，每孔分別加入當(dāng)天用含10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液稀釋的0.5、1、2、4 mg/L的Photosan(德國(guó)SeeLab公司，批號(hào)940601)溶液100 μl，避光繼續(xù)培養(yǎng)8 h。棄Photosan的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液100 μl/孔后立即給予激光照射，波長(zhǎng)630 nm，光照能量為1、5、10 J/cm2，光斑直徑為5 cm，光照時(shí)間為7 min。每組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。同時(shí)設(shè)單純光敏劑組、單純光照組及空白組。光照后繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞24 h。每孔加入5 mg/ml MTT溶液20 μl，繼續(xù)孵育4 h，棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清，加100 μl DMSO，恒溫振蕩10 min。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組A492值，取均值。A492值間接反映活細(xì)胞數(shù)量，并與其成正比。

二、流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PANC1細(xì)胞，在3個(gè)直徑5 cm培養(yǎng)皿各接種2×105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)24 h。棄培養(yǎng)液，分別加入0、2、4 mg/L濃度的Photosan溶液5 ml，避光繼續(xù)培養(yǎng)8 h。吸出含Photosan的培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液5 ml，給予10 J/cm2激光照射，光斑直徑為5 cm，光照時(shí)間為7 min。照光后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，胰酶消化，離心收集細(xì)胞，PBS洗滌3次后將細(xì)胞重懸于200 μl 結(jié)合緩沖液，加入10 μl Annexin-v-FITC和5 μl PI，混勻后避光室溫反應(yīng)15 min，加入300 μl緩沖液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、PDT對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷效應(yīng)

不加光敏劑Photosan或不進(jìn)行光照，對(duì)細(xì)胞均無(wú)殺傷效應(yīng)。添加0.5 mg/L Photosan時(shí)，不同光照劑量對(duì)細(xì)胞的殺傷無(wú)顯著變化；添加1 mg/L Photosan時(shí)，10 J/cm2的光照對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)較0、1、5 J/cm2光照劑量顯著增加(P<0.05)；添加2 mg/L Photosan時(shí)，5 J/cm2和10 J/cm2的光照對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)較1 J/cm2光照劑量顯著增加(P<0.05)；添加4 mg/L Photosan時(shí)，所有光照劑量均對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生明顯的殺傷效應(yīng)(P<0.01，表1)。Photosan濃度和光照劑量之間既存在交互作用(P<0.05)，又存在獨(dú)立效應(yīng)(P<0.05)。但10 J/cm2與5 J/cm2光照對(duì)細(xì)胞的殺傷效應(yīng)無(wú)顯著差異。

表1 人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1經(jīng)不同濃度Photosan和不同劑量光照后的A492值

注：與0、1 J/cm2和5 J/cm2比較，aP<0.05，與0、1 J/cm2比較，bP<0.05，cP<0.01；與0 J/cm2比較，dP<0.01

二、PDT對(duì)PANC1細(xì)胞凋亡的影響

光照劑量為10 J/cm2時(shí)，0、2、4 mg/L Photosan濃度時(shí)的細(xì)胞凋亡率分別為(13.8±1.8)%、(40.9±1.6)%、(62.5±2.0)%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1)。

a.0 mg/L Photosan；b.2 mg/L Photosan；c.4 mg/L Photosan

光動(dòng)力治療(PDT)是腫瘤治療領(lǐng)域中的一項(xiàng)創(chuàng)傷小、對(duì)腫瘤特異性高的新技術(shù)。PDT的基礎(chǔ)是光化學(xué)或光生物學(xué)反應(yīng)[3]。其原理是利用光敏劑能在腫瘤組織中選擇性積聚、潴留的特性，經(jīng)特定波長(zhǎng)的光照，并在氧分子的參與下，使腫瘤組織內(nèi)的三態(tài)氧變?yōu)榇罅坑卸镜膯螒B(tài)氧、羥基團(tuán)和過(guò)氧化基團(tuán)等，造成細(xì)胞中線粒體、溶酶體及核膜、細(xì)胞膜的腫脹、破壞，同時(shí)產(chǎn)生血栓素，使腫瘤血管栓塞，致腫瘤細(xì)胞死亡[4]。

目前有關(guān)PDT殺傷腫瘤細(xì)胞的研究多集中在體表皮膚腫瘤和腔道腫瘤，如食管癌、支氣管肺癌、膀胱癌等，對(duì)實(shí)體臟器腫瘤方面的報(bào)道甚少。隨著激光醫(yī)學(xué)、光敏劑和內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展，臨床PDT治療胰腺癌將越來(lái)越成為可能。本實(shí)驗(yàn)選取目前臨床上最常用的血卟啉衍生物光敏劑——Photosan，觀察不同濃度光敏劑和光照劑量對(duì)人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC1的殺傷效應(yīng)。結(jié)果顯示，單純給予Photosan或單純光照，均無(wú)PDT效應(yīng)，說(shuō)明光敏劑和特定波長(zhǎng)的光照都是光動(dòng)力殺傷腫瘤細(xì)胞作用中缺一不可的重要因素，這符合光動(dòng)力治療的基本特點(diǎn)[5]。同時(shí)也提示，光敏劑或相應(yīng)波長(zhǎng)的激光，并不具備獨(dú)立的生物學(xué)效應(yīng)，正常組織單獨(dú)接觸時(shí)是安全的。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，當(dāng)Photosan>1 mg/L、光照劑量>1 J/cm2時(shí)才表現(xiàn)出PDT對(duì)PANC1細(xì)胞的殺傷作用，且隨著光敏劑濃度和光照劑量的增加，其殺傷作用亦相應(yīng)增強(qiáng)，原因可能與細(xì)胞對(duì)光敏劑的吸收、代謝與排泄的特性以及一定強(qiáng)度的光能量才足以激發(fā)光化學(xué)反應(yīng)有關(guān)。與陳曉華等[6]對(duì)食管癌細(xì)胞的PDT研究結(jié)果類似。不過(guò)，本實(shí)驗(yàn)的光照劑量達(dá)到5 J/cm2以上后，PDT效應(yīng)卻無(wú)顯著增加，這可能與細(xì)胞存在光照飽和有關(guān)。因該劑量的激光已引發(fā)光敏劑產(chǎn)生幾乎最大程度的光化學(xué)反應(yīng)。

PDT殺傷細(xì)胞有兩種主要方式：凋亡和壞死。有學(xué)者認(rèn)為，細(xì)胞種類、光敏劑的種類及其在亞細(xì)胞上的定位、光照劑量是決定此二種方式的主要因素[7]。本實(shí)驗(yàn)用最大有效光照劑量10 J/cm2時(shí)，細(xì)胞的凋亡率隨光敏劑濃度的增加而相應(yīng)增加，提示添加血卟啉衍生物的PDT對(duì)PANC1細(xì)胞殺傷效應(yīng)的胞內(nèi)機(jī)制可能與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

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2009-09-14)

(本文編輯：屠振興)

Hematoporphyrinderivativephotodynamictherapyofhumanpancreaticcancercellsinvitro

YUZhong,HUANGKai-hong,WANGLing-yun,ZHUZhao-hua,CHENRu-fu,ZHANGJin-xin.

DepartmentofGastroenterology,SecondAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

ZHUZhao-hua,Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn

ObjectiveTo investigate the killing effect of hematoporphyrin derivative photodynamic therapy (PDT) on cultured human pancreatic cancer cell, and to explore the mechanism of this effect.MethodsBiolitec PDT 630 semi-conductor laser therapeutic apparatus was used as the light source. After pancreatic cancer cell PANC1 was incubated 8 h with different concentrations of Photosan (hematoporphyrin derivative) as photosensitizer (0.5mg/L, 1 mg/L, 2 mg/L, 4 mg/L), the cells were given different doses of 630nm laser irradiation (1 J/cm2,5 J/cm2,10 J/cm2). TheA492value was determined in each group with MTT method. Cell apoptosis rate was detected by flow cytometry after PDT.ResultsThere was no killing effect when no Photosan was administrated; 10 J/cm2irradiation had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 1 mg/L(0.140±0.013vs0.213±0.008,P<0.05) ; 5 and 10 J/cm2irradiation all had killing effect on PANC1 when Photosan was administrated as 2 mg/L (0.081±0.024 and 0.049±0.013vs0.211±0.031,P<0.05 andP<0.01); all doses of irradiation had killing effect when Photosan was administrated as 4 mg/L. There was no significant difference between 5 and 10 J/cm2irradiation in term of killing effect. Cell apoptosis rates with 0 or 2 or 4 mg/L Photosan and 10 J/cm2irradiation were (13.8±1.8)%,(40.9±1.6)%, (62.5±2.0)%, the difference was statistically significant (P<0.05).ConclusionsPhotosensitizer or irradiation alone did not produce PDT effect. With certain dose of photosensitizer and irradiation, the PDT effect increased accordingly.

Pancreatic neoplasms; Photodynamic Therapy; Hematoporphyrin derivative; Cell line

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.01.011

廣東省自然科學(xué)基金(06021369) 廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2006043)

510120 廣州，中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科(于鐘、黃開(kāi)紅、王凌云、朱兆華)，外科(陳汝福)；中山大學(xué)醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)與流行病學(xué)系(張晉昕)

朱兆華，Email:zhuzhaoh@mail.sysu.edu.cn