彭泉 蔡輝華 高文濤 錢祝銀 苗毅

·論著·

胰腺癌細(xì)胞株HOXA7基因表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

彭泉 蔡輝華 高文濤 錢祝銀 苗毅

目的檢測HOXA7 mRNA在胰腺癌細(xì)胞株中的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，探討兩者的相關(guān)性。方法采用RT-PCR法檢測人胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、CFPAC1、PANC1和SW1990細(xì)胞的HOXA7 mRNA的表達(dá)水平。采用重亞硫酸鹽測序PCR(bisulfite sequencing PCR，BSP)和結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)檢測啟動(dòng)子區(qū)域甲基化狀態(tài)。應(yīng)用去甲基化藥物5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-dC)處理各細(xì)胞株，檢測處理前后細(xì)胞HOXA7 mRNA表達(dá)和甲基化狀態(tài)的變化。結(jié)果胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、CFPAC1和SW1990細(xì)胞均表達(dá)HOXA7 mRNA，而PANC1細(xì)胞不表達(dá)HOXA7 mRNA。CFPAC1、BxPC3、PANC1和SW1990中HOXA7啟動(dòng)子甲基化率分別為93.16%、90.65%、90.09%、52.30%，SW1990細(xì)胞的HOXA7 甲基化率較其他三株細(xì)胞均明顯降低(P值均<0.01)。經(jīng)5-aza-dC處理后，PANC1細(xì)胞的HOXA7 mRNA重新表達(dá)，BxPC3的HOXA7 mRNA表達(dá)增強(qiáng)；而CFPAC1和SW1990細(xì)胞的HOXA7 mRNA在5-aza-dC處理前后無明顯變化。結(jié)論胰腺癌細(xì)胞株BxPC3和PANC1細(xì)胞的HOXA7mRNA表達(dá)與啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，而CFPAC 1和 SW1990細(xì)胞兩者無明顯相關(guān)性。

胰腺腫瘤； DNA甲基化； HOXA7基因； 5-氮雜胞苷

DNA甲基化(DNA methylation)是最早被發(fā)現(xiàn)的表觀遺傳學(xué)改變途徑之一。位于啟動(dòng)子區(qū)的CpG島甲基化通常會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)沉默，并伴隨腫瘤的發(fā)生[1-2]。Homebox基因家族是在包括人在內(nèi)的動(dòng)物胚胎發(fā)育和細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用的一類基因[3-4]，其編碼的蛋白是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可調(diào)節(jié)胚胎發(fā)育和生長分化。 HOXA7基因?qū)儆贖omebox家族Ⅰ類A簇，其編碼蛋白是一種DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)基因的表達(dá)和分化。Rauch等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌細(xì)胞株和早期肺鱗狀細(xì)胞癌組織中，HOXA7基因的啟動(dòng)子區(qū)呈高甲基化狀態(tài)，提示HOXA7基因可能會(huì)在肺癌的診斷和治療中發(fā)揮作用。但HOXA7基因在胰腺癌中的表達(dá)狀況尚未明確。因此，我們檢測4株胰腺癌細(xì)胞株HOXA7基因的表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)，探討胰腺癌細(xì)胞HOXA7基因表達(dá)水平與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化的相關(guān)性。

材料與方法

一、 細(xì)胞培養(yǎng)及處理

胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、CFPAC1、SW1990、PANC1由南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科實(shí)驗(yàn)室保存，常規(guī)培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期細(xì)胞，按5×106/ml的濃度接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后換液，加入5 μmol/L的5-aza-dC(美國Sigma公司)培養(yǎng)96 h，每24 h更換含同樣濃度5-aza-dC的培養(yǎng)液。

二、HOXA7 mRNA表達(dá)的檢測

應(yīng)用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，取1 μgRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。HOXA7引物序列：上游5′-GCCTCCTACGACCAAAACAT-3′，下游5′-GTCTGGTAGCGCGTGTAGGT-3′，擴(kuò)增長度179 bp。以β-actin為內(nèi)參照，引物序列：上游5′-TTGCGTTACACCCTTTCTT-3′，下游5′-TGTCACCTTCACCGTTCC-3′，擴(kuò)增長度149 bp。PCR反應(yīng)條件：95℃ 5 min,94℃ 30 s、65℃ 30 s、72℃ 30 s,35個(gè)循環(huán)，72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物于2﹪瓊脂糖凝膠電泳分離，凝膠成像系統(tǒng)分析儀攝片，掃描分析灰度值。

三、HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化檢測

按照DNA提取試劑盒(美國Omega公司)說明書提取細(xì)胞基因組DNA，進(jìn)行重亞硫酸鹽處理。具體步驟：取DNA約4 μg稀釋至50 μl，加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，37℃變性10 min。加入30 μl新配制的10 mmol/L的對苯二酚及520 μl 3 mol/L NaHSO3(以10 mol/L的NaOH調(diào)整pH值至5.0)，混勻，避光，置于50℃水浴16 h。應(yīng)用 Wizard DNA純化試劑盒(Promega公司)純化修飾后的DNA，于室溫下加入5.5 μl 3 mol/L的NaOH，放置15 min。加入2 μl 10 mg/ml糖原，66 μl 10 mol/L乙酸銨及450 μl冰乙醇過夜，離心，洗滌，室溫下干燥，加60 μlTE(pH 8.0)溶解，-20℃保存。甲基化酶處理基因組DNA按照試劑操作步驟進(jìn)行，使雙鏈DNA上的胞嘧啶全部甲基化。

四、結(jié)合重亞硫酸鹽的限制性內(nèi)切酶法(combined bisulfite restriction analysis，COBRA)檢測

以亞硫酸鹽修飾后的DNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：樣品DNA 2 μl，10×Buffer 5 μl，上下游引物各2 μl(上游：5′-TTTAGAATGGAAGGGTAAGAGG-3′，下游：5′-CAAACCCCAATACRAAAATTA-3′)，dNTP 2.5 μl，F(xiàn)ast-Taq酶 0.2 μl,去離子H2O 36.3 μl。在Touchdown-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95℃ 5 min,94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 30 s,2個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 30 s，3個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，64℃ 30 s，72℃ 30 s，4個(gè)循環(huán)；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)。以甲基化酶(SSSI)處理與未處理的正常人的外周血細(xì)胞DNA分別作為陽性和陰性對照。取部分PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分離，Bio-Rad自動(dòng)成像儀成像。取部分PCR產(chǎn)物進(jìn)行HhaI酶切，反應(yīng)體系：PCR產(chǎn)物10 μl，去離子H2O 18 μl，10×Buffer Tango 2 μl，HhaI 2 μl，酶切8 h后行聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳，EB染色，攝片。Quantity One軟件進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算甲基化率。

結(jié) 果

一、胰腺癌細(xì)胞株HOXA7 mRNA的表達(dá)

胰腺癌細(xì)胞株BxPC3、CFPAC1、SW1990擴(kuò)增出179 bp大小的目的條帶，而PANC1細(xì)胞株未檢測到HOXA7 mRNA的表達(dá)(圖1)。

圖1 4種胰腺癌細(xì)胞株HOXA7 mRNA表達(dá)

二、HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

甲基化率(%)=lane2/(lane1+lane2)×100%(圖2，因產(chǎn)物被酶切為70、71 bp，故酶切后為兩條帶)。 CFPAC1、BxPC3、PANC1和SW1990中HOXA7啟動(dòng)子甲基化率分別為93.16%、90.65%、90.09%、52.30%，與SW1990相比，其他三株胰腺癌細(xì)胞株HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯增高(P值均<0.01)。

圖2 5-aza-dC處理前后胰腺癌細(xì)胞株COBRA圖

三、5-aza-dC處理前后HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化率與HOXA7 mRNA表達(dá)的變化

5-aza-dC處理后，CFPAC1、BxPC3、PANC1、SW1990細(xì)胞HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率分別為92.30%、59.73%、45.68%、37.98%(圖3)。與未處理前相比，BxPC3、PANC1細(xì)胞株的甲基化率顯著下降(P<0.05)。處理前BxPC3細(xì)胞HOXA7 mRNA輕度表達(dá)，經(jīng)過5-aza-dC處理后表達(dá)明顯上調(diào)；處理前PANC1細(xì)胞HOXA7 mRNA 不表達(dá)，處理后HOXA7 mRNA重新表達(dá)；CFPAC1與SW1990細(xì)胞的HOXA7 mRNA表達(dá)在處理前后無明顯改變(圖4)。

圖35-aza-dC處理前后胰腺癌細(xì)胞株HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化率的變化

圖45-aza-dC處理前后胰腺癌細(xì)胞株HOXA7 mRNA表達(dá)變化

討 論

胚胎發(fā)育是受多基因調(diào)控的生物學(xué)過程,胚胎調(diào)控平衡的紊亂可導(dǎo)致疾病的發(fā)生,其中也包括腫瘤的發(fā)生。因此, 研究與胚胎相關(guān)的基因是發(fā)現(xiàn)可用于臨床的腫瘤標(biāo)記物的重要途徑之一[6-7]。HOXA7(又稱為HOX1.1)是HOX家族中最早被發(fā)現(xiàn)的基因，其異常表達(dá)及功能在白血病中研究較多，而在實(shí)體腫瘤的研究較少。文獻(xiàn)報(bào)道[8-10]，HOXA7在食管癌、卵巢癌和胃癌中的表達(dá)增強(qiáng)，提示HOXA7可能作為一個(gè)癌基因在這些組織的腫瘤形成和進(jìn)展中發(fā)揮作用。Drabkin等[11]報(bào)道，HOXA7mRNA高表達(dá)的急性粒細(xì)胞性白血病患者的預(yù)后較差。Kawagoe等[12]報(bào)道，MLL-AF9基因可通過上調(diào)HOXA7的表達(dá)抑制白血病細(xì)胞株THP-1細(xì)胞的凋亡。Afonja等[13]發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)meis1基因高表達(dá)可以促進(jìn)AML(acute myeloid leukemia)細(xì)胞的凋亡，而meis1與HOXA7共同表達(dá)時(shí)則抑制該細(xì)胞的凋亡。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，HOXA7 mRNA高表達(dá)的患者化療效果較差。這些結(jié)果都說明HOXA7基因可能在腫瘤的發(fā)生與進(jìn)展中起到抑制細(xì)胞凋亡的作用。

有關(guān)HOXA7基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制，Joh等[14]報(bào)道，MLL基因在造血細(xì)胞中可以正向調(diào)節(jié)HOXA7的表達(dá)。Lee等[15]在F9畸胎瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，一個(gè)新的促細(xì)胞凋亡基因JpK也可以調(diào)節(jié)HOXA7的表達(dá)。Ota等[16]在卵泡的研究中發(fā)現(xiàn)，生長分化因子-9 (growth differentiation factor-9，GDF-9)可以上調(diào)HOXA7的蛋白表達(dá)水平。此外，Wu等[17]采用高壓液相色譜法分析發(fā)現(xiàn)HOXA7基因的高甲基化與啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合NSPc1、EZH2有關(guān)，將NSPc1基因敲除后可使HOXA7基因啟動(dòng)子區(qū)上的DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶 1 (Dnmt1)分離，降低其甲基化率，使HOXA7 mRNA重新表達(dá)，提示HOXA7 mRNA的表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)相關(guān)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PANC1細(xì)胞不表達(dá)HOXA7 mRNA，經(jīng)去甲基化藥物5-aza-dC處理后，HOXA7啟動(dòng)子區(qū)甲基化率明顯下降，HOXA7基因重新表達(dá)；同樣，BxPC3細(xì)胞經(jīng)5-aza-dC處理后，甲基化率明顯下降， HOXA7 mRNA的表達(dá)也顯著增強(qiáng)，表明這兩株細(xì)胞的HOXA7 mRNA表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)密切相關(guān)。但是， CFPAC1和SW1990細(xì)胞在5-aza-dC處理前后的甲基化率無明顯變化，HOXA7 mRNA的表達(dá)也無差異，提示這兩株細(xì)胞HOXA7 mRNA表達(dá)與其啟動(dòng)子區(qū)甲基化狀態(tài)無明顯相關(guān)性，HOXA7 mRNA的表達(dá)可能受其他因素調(diào)控，需進(jìn)一步探討。

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2010-05-14)

(本文編輯：呂芳萍)

歡迎訂閱《中華胰腺病雜志》

ExpressionandpromotermethylationstatusofHOXA7geneinpancreaticcancercellline

PENGQuan,CAIHui-hua,GAOWen-tao,QIANZhu-yin,MIAOYi.

DepartmentofGeneralSurgery,PLA105Hospital,Hefei230031,China

QIANZhu-yin,Email:qianzhusilver@163.com

ObjectiveTo investigate the expression and methylation status of HOXA7 gene in human pancreatic cancer cell lines, and to explore the relationship between them.MethodsHOXA7 mRNA expression of human pancreatic cancer cell lines BxPC3, CFPAC1, PANC1 and SW1990was detected by RT PCR. Bisulfite sequencing PCR (BSP) and combined bisulfite restriction analysis (COBRA) was used to test promoter methylation status. All the cell lines were treated by 5-aza-2-deoxycytidine (5-aza-dC), and HOXA7 mRNA expression, methylation status was detected before and after this treatment.ResultsHOXA7 mRNA was expressed in BxPC3, CFPAC1 and SW1990, while there was no expression of HOXA7 mRNA in PANC1. HOXA7 promoter methylation rates of CFPAC1, BxPC3, PANC1 and SW1990 were 93.16%, 90.65%, 90.09%, 52.30%. HOXA7 promoter methylation rate of SW1990 was significantly lower than those in other 3 cell lines (P<0.01). After 5-aza-dC treatment, HOXA7 mRNA of PANC1 was expressed again, and HOXA7 mRNA of BxPC3 was increasingly expressed; while the expression of HOXA7 mRNA in CFPAC1 and SW1990 was not significantly changed after 5-aza-dC treatment.ConclusionsThe expression of HOXA7 mRNA in BxPC3 and PANC1 was closely correlated with promoter hypermethylation, while there was no obvious relation in CFPAC 1 and SW1990.

Pancreatic neoplasms; DNA methylation; HOXA7 genes; 5-aza-dC

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.06.017

江蘇省自然科學(xué)基金(BK2006241)；國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(30500492)

230031 合肥，安徽合肥解放軍第105醫(yī)院普外科(彭泉)；南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院普外科(蔡輝華、高文濤、錢祝銀、苗毅)

錢祝銀，Email：qianzhusilver@163.com