許海玲 黃中偉 薛育政

P選擇素在急性壞死性胰腺炎大鼠血小板中的表達(dá)

許海玲 黃中偉 薛育政

胰腺炎的發(fā)病機(jī)制有胰腺自身消化學(xué)說、自由基的破壞學(xué)說、胰腺的微循環(huán)紊亂學(xué)說、胰腺腺泡內(nèi)鈣超載學(xué)說、白細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞相互作用學(xué)說、炎癥介質(zhì)學(xué)說，但均無法單獨(dú)地解釋胰腺炎復(fù)雜的發(fā)病過程及臨床表現(xiàn)。本實(shí)驗(yàn)檢測急性壞死性胰腺炎(ANP)大鼠血小板表面P-選擇素的表達(dá)，探討其在重癥急性胰腺炎(SAP)發(fā)病中的作用。

一、材料與方法

1．實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及模型制備：48只健康SD大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，雌雄不拘,清潔級(jí)，體重(260±10)g。隨機(jī)分為生理鹽水組和ANP組。胰膽管逆行注射5%?；悄懰徕c1 ml/kg體重制備ANP模型，生理鹽水組注射等容積無菌生理鹽水。術(shù)后1、3、6 、12 h分批各處死6只大鼠，取血和胰腺組織。

2．血小板表面P選擇素(CD62P)的檢測：各時(shí)間點(diǎn)抽取的新鮮血液用3.8%枸櫞酸鈉抗凝，15 min內(nèi)加入等量新鮮配置的2%多聚甲醛(pH 7.2)固定30 min，室溫下800 r/min離心5 min，取上清50 μl，加入1 ml磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，1500 r/min離心5 min，棄上清，重復(fù)此步驟2次。PBS稀釋，血小板計(jì)數(shù)，調(diào)整血小板濃度為10×109/L。取100 μl，加入1 μg(20 μl)FITC標(biāo)記的羊抗大鼠CD62P抗體(1 μg可檢測106個(gè)血小板)，室溫下避光作用30 min，1 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀(美國Becton-Dickinson公司)檢測，以加PBS作為對(duì)照管。獲取數(shù)據(jù)用Cell quset軟件分析，得出CD62P陽性血小板百分率及平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity，MFI)。

3．胰腺組織病理學(xué)檢測：胰腺組織常規(guī)石蠟包埋、切片、HE染色，病理科醫(yī)師盲法按Rongione等[1]的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

二、結(jié)果

1．血小板CD62P表達(dá)的變化：生理鹽水組術(shù)后1、3、6、12 h的血小板CD62P陽性百分率分別為(48.5±0.7)%、(55.8±0.1)%、(58.5±0.3)%、(63.4±2.7)%；MFI分別為21.4±0.7、25.8±2.5、35.8±2.7、43.2±3.8。ANP組血小板CD62P陽性百分率分別為(53.3±0.8)%、(71.1±0.9)%、(77.1±2.0)%、(89.1±3.3)%；MFI分別為24.6±1.1、41.4±3.8、48.6±3.5、112.3±6.5(圖1)。ANP組CD62P陽性率和MFI均明顯高于同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組(P值均<0.01)。此外，兩組血小板表面CD62P陽性率和MFI均呈時(shí)間依賴性升高(P<0.05或P<0.01)，術(shù)后12 h達(dá)到峰值。

2．胰腺組織病理損傷評(píng)分：生理鹽水組術(shù)后1、3、6、12 h的胰腺病理評(píng)分分別為0.22±0.17、0.31±0.01、0.41±0.01、0.63±0.01，ANP組分別為3.30±0.10、4.30±0.16、5.46±0.11、9.45±0.13，ANP組均顯著高于同時(shí)間點(diǎn)生理鹽水組(P值均<0.01)，并呈時(shí)間依賴性升高(P<0.05)，術(shù)后1 2 h達(dá)到峰值。

討論P(yáng)選擇素，即CD62P，是黏附分子家族的成員之一，主要位于血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞膜上。其配體主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞。P選擇素與其受體結(jié)合可介導(dǎo)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，在白細(xì)胞趨向感染區(qū)域的早期階段具有重要作用；同時(shí)在炎癥反應(yīng)的擴(kuò)散中起著重要作用。由內(nèi)皮細(xì)胞P選擇素介導(dǎo)的血小板在內(nèi)皮細(xì)胞表面滾動(dòng)參加止血反應(yīng)[2]，通過活體內(nèi)顯微鏡觀察，靜脈中軸流的血小板緊隨著紅細(xì)胞流動(dòng)，而靠近血管壁的血小板流速顯著比紅細(xì)胞低，并大多數(shù)在內(nèi)皮表面滾動(dòng)[3]，這就有利于血小板接近內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步黏附于破損處，并募集更多的血小板參加聚集反應(yīng)，可以說是止血反應(yīng)的前奏。Bertuglia等[4]證實(shí)，血小板聚集可導(dǎo)致血液凝固，血栓形成，造成血管堵塞,微循環(huán)障礙，在器官功能衰竭中起重要作用。Ishikawa等[5-6]證實(shí)，缺血可導(dǎo)致血小板及白細(xì)胞聚集，而血小板與白細(xì)胞，血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞間的黏附均依賴P選擇素及其配體。將ITF持續(xù)滴入缺血/再灌注SD大鼠模型靜脈內(nèi)，可導(dǎo)致黏附到血管壁上的血小板及白細(xì)胞明顯減少，微血管炎癥及血小板聚集明顯減少[4]。ITF是通過抑制Weibel-Palade小體分泌P選擇素發(fā)揮這種作用的。

圖1ANP組(左列)和生理鹽水組(右列)大鼠血小板CD62P陽性表達(dá)率及平均熒光強(qiáng)度

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，ANP組血小板表面CD62P的陽性表達(dá)率和平均熒光強(qiáng)度(MFI)均明顯高于對(duì)照組，并隨著模型制作后時(shí)間的延長而增強(qiáng)，同時(shí)胰腺組織病理損傷程度也隨著模型制作后時(shí)間的延長而加重，提示血小板CD62P的表達(dá)與胰腺損傷程度呈正相關(guān)。因此，檢測血小板表面CD62P也可能作為胰腺損傷程度的指標(biāo)之一。

[1] Rongione AJ,Kusske AM,Ashley SW,et al.Interleukin 10 reduces the severity of acute pancreatitis in ras.Gastroenterology,1997,112：960-967.

[2] Frenette PS,Moyna C,Hartwell DW,et al.Platelet-endothelial interactions in inflamed mesenteric veneles.Blood,1998,91：1318-1324.

[3] Katayama T,Ikeda Y,Handa M,et al.Immunoneutralization of glycoprotein Ibalpha attenuates endotoxin-induced interactions of platelets and leukocytes with rat venular endothelium in vivo.Circ Res,2000,86：1031-1037.

[4] Bertuglia S,Ichimura H,Fossati G, et al. ITF1697,a Stable Lys-Pro-containing peptide,inhibits weibel-palade body exocytosis induced by ischemia/reperfusion and pressure elevation.Mol Med,2007,13：615-624.

[5] Ishikawa W,Zhang JH,Nanda A,et al.Inflammatory responses to ischemia and reperfusion in the cerebral microcirculation.Front Biosci,2004,9：1339-1347.

[6] Ishikawa M,Sekizuka E,Yamaguchi N,et al.Angiotention Ⅱ type 1 receptor signaling contributes to platelet-leukocyte-endothelial cell interactions in the cerebral microvasculature.Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292：H2306-H2315.

2009-06-01)

(本文編輯：屠振興)

10.3760/cma.j.issn.1674-1935.2010.03.024

226000 南通，南通大學(xué)附屬醫(yī)院急診科(許海玲、黃中偉);無錫市第三人民醫(yī)院消化內(nèi)科(薛育政)

黃中偉,Email:doctorhzw@yahoo.com.cn