徐君怡，曹際娟，于 珂，徐 楊

（遼寧出入境檢驗檢疫局，遼寧大連 116015)

地球上目前存在的食肉動物大概有11個科，而最有特點并最重要的就是貓科動物。獅，俗稱獅子，就是一種生存在非洲和亞洲的大型貓科動物。獅屬于哺乳綱（Mammalia），食肉目（Carnivora），貓科（Felidae），豹屬（Panthera），獅種（P.leo）。獅種中約有13~14個亞種，其中，歐洲獅、巴巴里獅、斑點獅、開普獅、喀啦哈里獅等五個亞種已經(jīng)在地球上絕跡，剩下的大部份亞種都生活在薩哈拉沙漠南的非洲[1]。

為了野生動物貿(mào)易能夠持續(xù)發(fā)展，各國制定了相應(yīng)的野生動物保護(hù)法規(guī)，禁止瀕危動物的捕殺和貿(mào)易。對一些受到絕滅威脅的物種限制其貿(mào)易量，以防止因狩獵和貿(mào)易對野生動物生存和持續(xù)利用造成威脅。國際上于1975年簽署了《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約（CITES）》，我國于1981年加入該公約。盡管公約的成員國已達(dá)160個，野生動物非法狩獵和野生動物走私活動在世界各地仍非常猖獗，繼續(xù)威脅著野生動物的生存。一些對獅虎豹皮和器官或制品有傳統(tǒng)需求的民族通過新近的發(fā)展獲得了新的經(jīng)濟(jì)水平，使得他們有足夠的財力來獲得摯愛的皮革、器官及其制品，這種需求極大地刺激了貓科動物的非法貿(mào)易，而國際間監(jiān)管、執(zhí)法艱難讓保護(hù)力量顯得過于蒼白。

在野生動物取證過程中，有些情況下其產(chǎn)品經(jīng)加工處理后失去了可辨認(rèn)的形態(tài)特征，使獅產(chǎn)品的鑒定工作十分困難。為了更有效地加強(qiáng)獅的保護(hù)工作，建立一種可以對獅DNA進(jìn)行特異性檢測的準(zhǔn)確性高、實用性強(qiáng)的方法，從分子水平對可疑來自于獅的樣品（例如食品、藥品、皮毛等）進(jìn)行特異性檢測鑒定，都是十分急需和必要的。有關(guān)獅DNA的特異性檢測研究，在國外僅見于Wetton等對貓科動物骨DNA進(jìn)行特異性檢測的相關(guān)報道。國內(nèi)對于該領(lǐng)域的研究幾乎未見報道。本研究通過篩選獅與其它動物在線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因片段的堿基差異合成特異引物，經(jīng)過PCR擴(kuò)增和凝膠電泳，達(dá)到了特異性檢測鑒定獅DNA的目的，并由此建立了一種靈敏、特異、簡便、快速、穩(wěn)定性好的獅DNA檢測方法。

1 研究方法

1.1 樣品種類及來源

本研究所用動物源性實驗樣品及其來源見表1，其中獅、虎、豹、熊等珍貴動物血液、毛發(fā)標(biāo)本由大連森林動物園動物飼養(yǎng)研究保護(hù)基地提供，亞洲獅肉為因病死亡動物標(biāo)本，經(jīng)遼寧省林業(yè)局批準(zhǔn)由大連森林動物園動物飼養(yǎng)研究保護(hù)基地提供。為確保樣品來源明確可靠，所采集的各種動物的毛發(fā)樣品均直接取自于動物體表或單獨飼養(yǎng)的籠舍。

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1.2 儀器

高速離心機(jī) 5804（Eppendorf，德國），普通 PCR 儀，（PE24000，美國），核酸蛋白分析儀（Beckman DU640），恒溫干燥箱（SANYO mov-213F，日本）。

1.3 引物合成

根據(jù)獅與其它多種貓科動物和哺乳動物mtDNA細(xì)胞色素 b基因序列的差異，及引物設(shè)計有關(guān)原則[2-4]，設(shè)計合成引物。引物序列由寶生物工程（大連）有限公司合成。引物序列為F:5'-CAAACCTGAATGGTACTTCCTA-3'，R:5'-AGATGGGTATTAGGATTA GAAGA-3'。

1.4 樣品制備

稱約100 g獅的肌肉組織，切碎，于120℃烘烤過夜，用組織研磨器研磨成粉末狀。將獅肉粉和牛肉骨粉樣品進(jìn)行混合以得到系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）的獅肉粉和牛肉骨粉混合物。

1.5 模板DNA制備

提取血液類試驗樣品基因組DNA用的Blood Genome DNA Extraction Kit試劑盒，購自寶生物工程（大連）有限公司，貨號D9081。其它組織類和骨粉類樣品采用動物源性植物飼料基因組DNA提取試劑盒，購自天根生化科技（北京）有限公司，貨號DP323-03。從動物毛中提取總DNA主要參照公安部物證鑒定中心人的毛發(fā)提取方法進(jìn)行[5]。

1.6 PCR擴(kuò)增條件

反應(yīng)采用25μL體系，按下列組分配置PCR反應(yīng)液：10×PCR緩沖液2μL、引物（10μmol/L）各1μL、dNTP（10 mmol/L）2μL、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）0.2μL、模板 DNA 1μL，加dH2O補(bǔ)足25μL。反應(yīng)條件如下：94℃ 3 min；94℃ 1 min，66℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環(huán)；72 ℃ 7 min結(jié)束反應(yīng)；4℃保存反應(yīng)產(chǎn)物。

1.7 PCR檢測的特異性分析

以表1中所列各物種的基因組DNA為模板，按照1.6 PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行獅源性制品的PCR檢測鑒定特異性試驗。

1.8 PCR檢測的靈敏度分析

將1.4中制備的獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）混合物，按照1.5模板DNA制備中的骨粉DNA提取方法進(jìn)行混合物基因組DNA的提取。系列混合物DNA用于檢測靈敏度分析。

2 結(jié)果

2.1 肌肉和血液樣品中PCR檢測特異性試驗

取表1中所列的17種血液、組織和骨粉類樣品的DNA進(jìn)行PCR檢測。獅種特異性檢測結(jié)果的PCR產(chǎn)物電泳圖譜如圖1所示。試驗結(jié)果顯示，獅種中亞洲獅亞種的血液、肌肉組織和毛發(fā)DNA樣本，東非獅亞種的血液DNA樣本經(jīng)過PCR擴(kuò)增，得到陽性擴(kuò)增產(chǎn)物。而虎、豹、熊的6種血液DNA樣本，牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿等8種哺乳動物骨粉DNA樣本以及空白水對照的檢測結(jié)果均為陰性。上述結(jié)果表明：試驗所設(shè)計引物為獅DNA的特異性擴(kuò)增引物，而且對來自于不同個體和不同組織的DNA具有同樣的擴(kuò)增效果。

2.2 毛干中PCR檢測特異性試驗

對亞洲獅、東北虎、金錢豹、波斯貓脫落毛發(fā)進(jìn)行DNA提取和擴(kuò)增。圖2顯示僅亞洲獅樣本出現(xiàn)特異性的擴(kuò)增條帶，而東北虎、金錢豹和波斯貓的毛發(fā)檢測結(jié)果均為陰性。上述結(jié)果可證明引物僅對獅特異。

2.3 靈敏度試驗

將1.4中制備的獅肉粉和牛肉骨粉系列百分比（100%，10%，1%，0.5%，0.1%）混合物，按照1.5模板DNA制備中的骨粉DNA提取方法進(jìn)行混合物基因組DNA的提取。該系列的混合物DNA用于進(jìn)行檢測靈敏度分析。按照1.6 PCR擴(kuò)增條件進(jìn)行試驗。結(jié)果顯示，使用1.6中的擴(kuò)增條件，可在含量為100%獅肉粉、10%獅肉粉、1%獅肉粉、0.5%獅肉粉中擴(kuò)增出特異性的PCR擴(kuò)增條帶（圖3）。表明本試驗設(shè)計的特異性PCR引物可檢出骨粉中0.5%的獅源成分。

3 討論

檢測鑒定獅屬制品可靠的反應(yīng)體系建立在合適的基因片段選擇上，所選的基因必需種屬特異性強(qiáng)，而在物種內(nèi)變異性要小。為了選擇一個合適的鑒定獅的基因片段，我們使用了歐洲分子生物學(xué)實驗室的數(shù)據(jù)庫（gene databanks，EMBL），比較其中足夠多的種間數(shù)據(jù)。在一些侯選基因片段中，選擇了線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因片段。在互聯(lián)網(wǎng)上數(shù)據(jù)比對的結(jié)果表明，這段基因序列有足夠的特異性可以滿足設(shè)計種屬特異性的引物對。線粒體細(xì)胞色素b（Cyt b）基因片段在脊椎動物中有很高的變異性。這里我們所設(shè)計的用來定性檢測獅源物質(zhì)的引物，在獅血、獅肉、獅毛樣品中均可以出現(xiàn)特異性PCR擴(kuò)增條帶，而且對來自于不同個體和不同組織的DNA具有同樣的擴(kuò)增效果。其他14種非獅源樣品（虎、豹、熊、牛、羊、馬、豬、狗、兔、驢、鹿）PCR反應(yīng)中沒有出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。

本研究所建立的對獅DNA進(jìn)行特異性檢測方法，是國內(nèi)少數(shù)正在進(jìn)行的獅 DNA檢測方法的研究，除具有高特異性、靈敏性外，因其具有簡便易行、快速、成本低等的特點而更具有實用性。此方法為海關(guān)、動植物檢疫以及動物保護(hù)組織提供了快速檢測鑒定獅制品的有效方法。

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[5]鄭秀芬.法醫(yī)DNA分析 [M]．北京:中國人民公安大學(xué)出版社，2002:53．