鄭貴浪　吳家興

[摘要] 目的 初步探討解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）在PM2.5致心肌細(xì)胞損傷中的作用。 方法 培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞株H9C2細(xì)胞，給予siRNA和（或）PM2.5刺激，48h后檢查肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH），RT-PCR及Western Blot檢測UCP2基因轉(zhuǎn)錄及蛋白水平，比色法檢測線粒體的活性氧（ROS）和ATP酶的活性。 結(jié)果 與PM2.5組相比，PM2.5+siRNA組心肌細(xì)胞CK和LDH明顯升高（969±21 vs 747±29U/mL，1071±59 vs 877±47U/L），ATP酶活性下降明顯（24.7±4.7 vs 40.2±4.9U/mgprot），細(xì)胞內(nèi)ROS明顯增多（90.2±6.2 vs 69.2±6.3U/Well），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 PM2.5可以導(dǎo)致UCP2基因表達(dá)代償性增多及心肌細(xì)胞損傷；RNA干擾沉默UCP2基因，會導(dǎo)致心肌損傷進(jìn)一步加重；提示UCP2在PM2.5致心肌損傷過程中可能起著保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 解偶聯(lián)蛋白2；PM2.5；H9C2；心肌細(xì)胞；線粒體；活性氧；ATP

[中圖分類號] R730.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 2095-0616（2015）01-40-05

[Abstract] Objective To investigate the effect of UCP2 during the injury procedure of PM2.5 on the rat myocardial cells H9C2. Methods Rat cardiomyocytes H9C2 cell lines were cultured， after 48 hours of given PM2.5 and （or） siRNA stimulus， creatine kinase （CK） and lactate dehydrogenase （LDH） were detected. The expession of UCP2 in transcription and translation levels was detected by RT-PCR and Western Blot respectively. Mitochondrial reactive oxygen species （ROS） and ATP enzyme activity were determinated by colorimetric detection. Results Compared with the PM2.5 group， CK and LDH were elevated （969±21 vs 747±29 U/mL，1071±59 vs 877±47 U/L）， ATP activity decreased （24.7±4.7 vs 40.2±4.9 U/mgprot）， intracellular ROS increased （90.2±6.2 vs 69.2±6.3 U/Well） in the PM2.5+siRNA group. And the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion PM2.5 can lead to myocardial cell damage and increased expression of UCP2 gene， and the silence of UCP2 by RNAi lead to aggravating injury of H9C2 cells， indicating that UCP2 may play an protective effect during the injury procedure of H9C2 caused by PM2.5.

[Key words] UCP2； PM2.5； H9C2； Myocardial cells； Mitochondria； ROS； ATP

近年來，大氣污染備受關(guān)注，其中顆粒物是城市大氣污染的重要物質(zhì)。根據(jù)粒徑大小可將其分為空氣動力學(xué)直徑介于2.5～10μm粗顆粒物（PM10）和空氣動力學(xué)直徑小于2.5μm的細(xì)顆粒物（PM2.5）。PM2.5與人體健康關(guān)系最密切。PM2.5化學(xué)成分復(fù)雜，包括無機(jī)成分、有機(jī)成分、微量重金屬元素、元素碳等，主要來自于人類活動如工業(yè)生產(chǎn)及交通運(yùn)輸工具尾氣排放、工業(yè)生產(chǎn)及取暖的燃燒釋放、吸煙的煙霧釋放等[1]。

動物試驗及臨床流行病學(xué)調(diào)查顯示，PM2.5與

人類心血管疾病有密切關(guān)系。PM2.5可促進(jìn)心肌細(xì)胞變性和間質(zhì)細(xì)胞增生，進(jìn)而導(dǎo)致以心肌間質(zhì)纖維化為主要表現(xiàn)的心肌重構(gòu)[2-3]；可以通過氧化應(yīng)激反應(yīng)損傷血管黏膜，引起血管通透性及血液黏度增加，加速主動脈和冠狀動脈粥樣硬化和斑塊破裂過程[4-5]；可以誘發(fā)心律失常、心肌缺血甚至心跳聚停等[6-7]。我們前期研究也表明，PM2.5可以導(dǎo)致H9C2心肌細(xì)胞線粒體損傷，導(dǎo)致活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生過多，ATP合成減少，線粒體膜電位損害。解偶聯(lián)蛋白（uncoupling proteins，UCPs）是線粒體內(nèi)膜上能夠通過轉(zhuǎn)運(yùn)H+降低線粒體膜電位蛋白家族，與細(xì)胞內(nèi)的ATP及ROS有著密切的關(guān)系[8-9]。在5種同類物中，UCP2分布最廣泛，體內(nèi)和體外的研究發(fā)現(xiàn)，UCP2可以通過降低膜電位，減少ROS產(chǎn)生進(jìn)而保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞組織[10]。

然而，UCP2在PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷過程中作用如何？目前研究甚少。本課題擬通過RNA干擾技術(shù)，沉默H9C2心肌細(xì)胞的UCP2表達(dá)，檢測PM2.5毒染心肌細(xì)胞的ROS、ATP改變及心肌細(xì)胞損傷指標(biāo)，初步探討UCP2在PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 RNA干擾片段

由上海吉凱基因公司合成2條RNA干擾片段和1條陰性對照RNA干擾片段，分別為siRNA1，siRNA2和ncRNA。siRNA1序列為：上游，5-GCA CUG UCG AAG CCU ACA A dTdT -3'；下游，5-UUG UAG GCU UCG ACA GUG C dTdT -3。siRNA2 序列為：上游，5- CCU CAU GAC AGA CGA CCU C dTdT -3；下游，5- GAG GUC GUC UGU CAU GAG G dTdT -3。ncRNA序列為：上游，5- UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT -3；下游，5- ACG UGA CAC GUU CGG AGA ATT -3。

1.2 siRNA轉(zhuǎn)染步驟

（1）轉(zhuǎn)染前1d，5×104H9C2細(xì)胞接種在24孔板上，0.5mL完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合達(dá)到70% ～ 80%；（2）在50μL無血清培養(yǎng)基加入2μL的siRNA，柔和混勻；（3）混勻lipofectamine試劑，用50μL無血清培養(yǎng)基稀釋1μL的lipofectamine試劑，輕輕混勻，室溫放置5min；（4）將稀釋好的siRNA和lipofectamine試劑混合，輕柔混勻，室溫放置20min，以便形成siRNA-ipofectamine復(fù)合物；（5）將100μL的siRNA-ipofectamine復(fù)合物加到含400μL完全培養(yǎng)基的細(xì)胞孔中，來回輕柔搖晃細(xì)胞培養(yǎng)板；（6）細(xì)胞在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，檢測轉(zhuǎn)染后UCP2的表達(dá)情況。用siRNA-CY3（廣州瑞博公司）轉(zhuǎn)染，通過熒光顯微鏡進(jìn)行效率驗證，計算轉(zhuǎn)染效率。本實驗轉(zhuǎn)染效率達(dá)到80%左右，說明該轉(zhuǎn)染步驟是可行的。

1.3 預(yù)實驗篩選

UCP2基因有效的干擾片段：將H9C2細(xì)胞隨機(jī)分成5組，即control組，lipo組，siRNA1組，siRNA2組，ncRNA組，分別給予同體積培養(yǎng)基、lipofectamine、siRNA1、siRNA2和ncRNA刺激，轉(zhuǎn)染步驟同1.2；轉(zhuǎn)染后48h檢測UCP2轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，步驟同1.4。

1.4 RT-PCR檢測UCP2基因表達(dá)

用TRIzol法提取H9C2細(xì)胞的總RNA，然后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)讀取的CT值對基因進(jìn)行相對定量。RT-PCR反應(yīng)體系為：forward/reverse引物各0.25?L，SYBP Green PCR master mix 5?L，cDNA模板4μL。PCR進(jìn)行45個循環(huán)，條件為：95℃，5min，95℃，15s，60℃ 30s。UCP2引物為：5- GGG CAC CTG TGG TGC TAC CTG-3（sense），5-ATG AGC TTT GCC TCC GTC CGC-3（antisense）；看家基因18s-RNA引物為：5-CCA TCC AAT CGG TAG TAG C -3（sense），5-GTA ATG GCG GGT CAT AAG-3（antisense）。

1.5 Western Blot檢測UCP2蛋白表達(dá)

用2×SDS裂解細(xì)胞，12000g/min 離心5min，提取總蛋白，然后用BCA法迅速進(jìn)行蛋白濃度定量。提取的總蛋白，加入2×SDS蛋白上樣緩沖液（按1∶1的比例），100℃煮沸5min，-20℃保存?zhèn)溆?。配?0% SDS-PAGE分離膠，5%的濃縮膠，微量進(jìn)樣器吸取30?g樣品緩慢加入樣品孔中，用100V進(jìn)行濃縮膠電泳20min，140V在分離膠中電泳40min。然后轉(zhuǎn)膜、封閉，加入一抗（proteintech 公司，貨號：11081-1-AP） 4℃過夜，PBST洗膜，加入二抗37℃反應(yīng)1h，用化學(xué)發(fā)光法（ECL）顯影。

1.6 PM2.5的采樣及其配制

選取湛江市區(qū)汽車流量大、污染較重的地區(qū)為采樣點。用PM2.5采樣儀采集PM2.5，超聲震蕩，洗脫顆粒物，冷凍真空干燥成干粉，-20℃保存?zhèn)溆?。配制：稱取一定量PM2.5干粉，經(jīng)紫外線照射后加入培養(yǎng)基溶液混勻，配制成終濃度為10，50，100μg/mL的溶液進(jìn)行預(yù)實驗。根據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，本實驗選用50μg/mL作為細(xì)胞毒染劑量。

1.7 H9C2細(xì)胞處理及分組

H9C2細(xì)胞株購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保存委員會細(xì)胞庫，用10%小牛血清培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；1～3d更換一次培養(yǎng)液。PBS輕柔沖洗，適量0.25%胰酶溶液消化等常規(guī)操作，進(jìn)行傳代及實驗。當(dāng)細(xì)胞生長至70%左右密度時，將細(xì)胞隨機(jī)分成三組，分別為NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組，每組3個樣本。三組細(xì)胞分別給予常規(guī)的培養(yǎng)基，50μg/mL的PM2.5培養(yǎng)基，含PM2.5（50μg/mL）與siRNA（80nmol/L）的培養(yǎng)基刺激。48h后檢測相關(guān)指標(biāo)。

1.8 肌酸激酶（CK）和乳酸脫氫酶（LDH）、ROS、線粒體ATP酶活力檢測

（1）H9C2細(xì)胞受刺激后48h，收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清液，按照試劑盒說明采用比色法進(jìn)行檢測CK和LDH濃度。乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒（比色法），貨號A020-1；肌酸激酶（CK）測定試劑盒（比色法），貨號A032；試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

（2）按照活性氧檢測試劑盒進(jìn)行操作，購自碧云天，貨號S0033。簡要步驟為：各組細(xì)胞經(jīng)過處理后，按照試劑說明用1∶1000無血清培養(yǎng)液稀釋DCFH-DA。去除細(xì)胞培養(yǎng)液，加入適當(dāng)體積稀釋好的DCFH-DA。37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20min，然后用無血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次。用熒光分光光度計檢測[12]，激發(fā)波長488nm和535nm。

（3）ATP酶可分解ATP生成ADP及無機(jī)磷，測定無機(jī)磷的量可判斷ATP酶活力的高低。按照試劑盒采用比色法檢測ATP酶活力（購自南京建成生物工程研究所，試劑盒貨號：A016-1）。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理

所有計量資料均以（）表示，并采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。方差齊時，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計，兩組間比較采用LSD法分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 干擾片段的篩選

control組，lipo組，ncRNA組，siRNA1組和siRNA2組間UCP2基因mRNA相對含量有顯著差異（F=3244，P<0.05）；control組，lipo組和ncRNA組兩兩之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（0.983±0.07，0.975±0.06，0.976±0.06；P>0.05）；與control組相比，siRNA1組，siRNA2組UCP2基因mRNA相對含量均顯著下降（0.983±0.07 vs 0.556±0.11，0.369±0.12，P<0.05）；其中siRNA2組下降尤其明顯，故選擇siRNA2作為UCP2基因的干擾片段進(jìn)行后續(xù)的實驗。

2.2 各組UCP2基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)

NC組，PM2.5組及PM2.5+siRNA組間UCP2基因mRNA相對含量及UCP2蛋白條帶相對密度值均有顯著差異（F1=899，F(xiàn)2=1057；兩者P<0.05）；UCP2基因mRNA相對含量及UCP2蛋白條帶相對密度值在PM2.5組明顯升高，而在PM2.5+siRNA組明顯降低，與NC組相比較，兩差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（兩者P<0.05）。

2.3 各組H9C2細(xì)胞CK及LDH水平

CK和LDH是反映心肌細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。本實驗發(fā)現(xiàn)，CK和LDH水平在PM2.5+siRNA組最高，在PM2.5組其次，在NC組最低，兩指標(biāo)在三組間的差異顯著，均有統(tǒng)計學(xué)意義（FCK=429，P<0.05；FLDH=106，P<0.05）。

2.4 各組H9C2細(xì)胞ROS和細(xì)胞內(nèi)ATP的水平

細(xì)胞ROS水平和ATP活性是反映線粒體功能的重要參數(shù)。本實驗發(fā)現(xiàn)，PM2.5+siRNA組心肌細(xì)胞內(nèi)ROS含量明顯高于PM2.5組，PM2.5組的ROS明顯高于NC組，三組兩兩之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FROS=86，P<0.05）；而NC組ATP活性高于PM2.5組，PM2.5組ATP活性高于PM2.5+siRNA組，三組兩兩之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（FATP=31，P<0.05）。見表2。

3 討論

近年來，環(huán)境污染越來越受到重視。PM2.5作為大氣污染的重要物質(zhì)，可作為載體吸附有毒重金屬、酸性氧化物、有機(jī)污染物、細(xì)菌和病毒等多種組分，嚴(yán)重危害人體健康。多項流行病學(xué)調(diào)查研究顯示PM2.5不但可增加高血壓、冠心病、糖尿病患者的心血管疾病發(fā)病率和死亡率，亦可增高健康人群心血管疾病發(fā)病率和死亡率[11-12]。PM2.5可誘發(fā)、加重人體的心血管病變，這一認(rèn)識被越來越多的學(xué)者所認(rèn)同。本實驗通過培養(yǎng)大鼠心肌細(xì)胞株，給予PM2.5刺激，發(fā)現(xiàn)CK和LDH明顯升高，提示PM2.5可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷。這與國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)的PM2.5對心血管系統(tǒng)的毒性作用相一致[13-15]。

線粒體是重要的細(xì)胞器，是細(xì)胞生物氧化和能量合成的重要部位，細(xì)胞能量的80%來源于線粒體的呼吸功能。此外，線粒體也是ROS產(chǎn)生的重要部位。正常的線粒體功能，是維持細(xì)胞內(nèi)充足ATP合成和低濃度的ROS的必備條件。線粒體的功能障礙，常常導(dǎo)致線粒體產(chǎn)生過多的ROS和ATP的生成不足或過多消耗，導(dǎo)致細(xì)胞或機(jī)體的過氧化損傷和能量缺乏。解偶聯(lián)蛋白（UCPs）是線粒體上的質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，屬于線粒體陰離子通道家族。UCPs基因有高度的保守性，有6個家族成員，在人僅表達(dá)UCP1-5。UCP2基因位于11號染色體，與UCP3緊密連鎖，相隔僅6000bp。UCP2蛋白廣泛表達(dá)于各種組織細(xì)胞，現(xiàn)在多數(shù)認(rèn)為其是保護(hù)性因素[16-18]。在神經(jīng)系統(tǒng)中的保護(hù)方面，UCP2可以通過解偶聯(lián)作用，將H+轉(zhuǎn)運(yùn)入線粒體，降低膜電位，減少ROS產(chǎn)生，維持細(xì)胞內(nèi)的ATP水平，達(dá)到保護(hù)細(xì)胞的作用[19-20]。

我們前期的實驗發(fā)現(xiàn)，PM2.5可以通過損害心肌細(xì)胞的線粒體，破壞線粒體膜電位和線粒體的超微結(jié)果，導(dǎo)致線粒體ROS產(chǎn)生過多，ATP合成減少，進(jìn)而損害細(xì)胞。然而，UCP2是否在PM2.5損害心肌細(xì)胞的線粒體的過程中起著保護(hù)作用，目前研究很少。RNA干擾是研究基因的流行技術(shù)。本實驗通過設(shè)計UCP2基因的干擾片段，進(jìn)行預(yù)實驗，篩選出siRNA2作為干擾序列進(jìn)行進(jìn)一步研究。siRNA2導(dǎo)致了UCP2基因在轉(zhuǎn)錄和蛋白均出現(xiàn)低水平的表達(dá)，為探討UCP2的在PM2.5毒性過程的作用提供了基礎(chǔ)。

本實驗發(fā)現(xiàn)，通過RNA干擾沉默UCP2的表達(dá)，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生增多和細(xì)胞內(nèi)ATP含量的減少，后者更進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞的損害，表現(xiàn)為CK和LDH的明顯升高。PM2.5導(dǎo)致的UCP2過表達(dá)可能是細(xì)胞的代償反應(yīng)，抑制UCP2表達(dá)將促進(jìn)細(xì)胞的進(jìn)一步損害。這就間接地表明，UCP2可能是PM2.5導(dǎo)致心肌細(xì)胞損害過程中的保護(hù)因素。然而，本實驗也存在明顯不足：（1）僅僅采用了沉默基因方法，沒有嘗試過表達(dá)UCP2，再觀察UCP2的作用；（2）指標(biāo)檢測方面沒有將線粒體膜電位及線粒體腫脹度，線粒體生物修復(fù)功能等方面加以研究UCP2的作用。

綜上所述，PM2.5可以導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷，代償性引起UCP2表達(dá)增加；RAN干擾UCP2表達(dá)后，會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)ROS過度增多及ATP活性下降，從而加重細(xì)胞的損害；這一結(jié)果間接地表明，UCP2基因在PM2.5導(dǎo)致的心肌細(xì)胞損傷過程中可能起著保護(hù)作用。

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（收稿日期：2014-10-17）