沈 泓,易 喻,梅建鳳,朱克寅,李 敏,應(yīng)國清

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 藥學(xué)院,浙江 杭州 310014;2.杭州博林生物技術(shù)有限公司,浙江 杭州 310018)

人絨促性素(human chorionic gonadotrophin,hCG)是人類受孕后胎盤合體滋養(yǎng)層細胞分泌的一種糖蛋白激素。在妊娠早期hCG的濃度迅速增高,檢測尿中的hCG即可證實妊娠[1]。有許多研究表明,在滋養(yǎng)層細胞腫瘤和非滋養(yǎng)層細胞腫瘤病人的血和尿中有游離的hCG的β亞基存在[2]。因此,研制高純度的hCG單克隆抗體對早孕、癌癥的檢測有重要的意義。傳統(tǒng)的用得最多的純化方法為鹽析-辛酸沉淀法、疏水色譜[3]、離子交換[4]等。這些方法操作復(fù)雜,步驟繁瑣,純化效率不高,產(chǎn)率和純度都很低。蛋白A親和色譜是純化抗體的一種重要的方法。A蛋白來源于金黃色葡萄球菌,有5個位點能夠與IgG的Fc段結(jié)合,一個偶聯(lián)在凝膠上的A蛋白分子至少能結(jié)合2個IgG分子。重組A蛋白可通過C端的半胱氨酸殘基與瓊脂糖凝膠單點偶合,增加了重組A蛋白與瓊脂糖凝的結(jié)合量,因此大大提高了重組A蛋白-瓊脂糖凝膠與抗體蛋白的結(jié)合能力[5-6]。這一特點使之非常適合用于純化腹水中的單克隆抗體。但目前尚未見利用蛋白A親和色譜方法純化hCG單克隆抗體的報道。本研究以純化的hCG為免疫原,利用經(jīng)典的淋巴細胞融合技術(shù),建立了穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交瘤細胞株,并對得到的單克隆抗體進行了純化和鑒定,以期為后續(xù)的早孕、腫瘤相關(guān)研究提供實驗基礎(chǔ)。

1 材 料

1.1 動物、細胞株

BALB/c小鼠,浙江省動物實驗中心,許可證:SCXK(浙2003-0001);F1小鼠,浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,許可證:SCXK(滬2007-0005);SP2/0骨髓瘤細胞,華安生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器

層流超凈臺SCV-4A1,Streamline Laboratory Products;三目倒置相差顯微鏡ELWD0.3T1-SNCP,Nikon;二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱3111,Thermo Electron Corporation;HiTrap rProtein A FF色譜柱(5mL)、AKTA purifier,GEHealthcare。

1.3 試劑

hCG(5 000 U/mg),ProSpec公司;HAT培養(yǎng)液,華安生物技術(shù)有限公司;PEG(相對分子質(zhì)量5 000),Sigma公司;胎牛血清(BSA),民海生物工程有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)液,吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;羊抗小鼠IgG-HRP,博士德生物工程有限公司。

2 方 法

2.1 免疫動物

取8周齡的BALB/c小鼠,用hCG抗原皮下多點免疫,每次免疫量為100μg/只,第1次免疫與等量的弗氏完全佐劑充分乳化,第2,3次免疫與等量的弗氏不完全佐劑充分乳化,每次間隔7d,融合前3 d腹腔直接注射抗原100μg加強免疫。

2.2 細胞融合

將小鼠處死,無菌摘取脾臟,研磨制取脾B淋巴細胞懸液,洗滌調(diào)整細胞濃度為1×107～5×107/mL備用。將免疫脾B淋巴細胞與處于對數(shù)生長期的骨髓瘤細胞按5∶1混合后離心棄上清,緩慢加入50%PEG溶液1mL,間隔1 min后,緩慢滴入無血清培養(yǎng)液,終止融合劑的作用,經(jīng)洗滌去除融合劑后加入所需量的細胞培養(yǎng)液,分種于96孔培養(yǎng)板孔內(nèi),每孔100μL。

2.3 雜交瘤細胞的篩選

在接種96孔培養(yǎng)板時,每孔加入HAT培養(yǎng)液100μL,2～3 d換液1/2,經(jīng)過2周的培養(yǎng)后,骨髓瘤細胞與B淋巴細胞的雜交瘤細胞即被選擇培養(yǎng)出,然后進行單克隆化。

克隆化方法用有限稀釋法,按實驗室常規(guī)方法進行,一般克隆化3～4次,直至克隆細胞生長的各個孔檢測100%抗體陽性為止。

2.4 單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定

體內(nèi)誘生法制備腹水,按實驗室常規(guī)方法進行。間接ELISA測抗體效價。將hCG抗原1.25 U/孔包被酶標(biāo)板,設(shè)置空白對照孔,37℃包被過夜;PBS-T(含有吐溫20的磷酸鹽緩沖液)浸洗3次,每孔加入封閉液(含1%BSA的PBS-T)200μL,37℃孵育2 h;PBS-T浸洗3次,每孔加入200μL待測樣,以封閉液梯度稀釋(10-1～10-8),37℃孵育1 h;PBS-T浸洗3次,每孔加入用封閉液按1∶3 000稀釋的羊抗小鼠IgG-HRP 100μL,37 ℃孵育 1 h;PBS-T浸洗3次,雙蒸水浸洗3次,每孔加入鄰苯二胺底物溶液100μL,置暗處反應(yīng)5 min,陽性孔變?yōu)樽攸S色,每孔加入2 mol/L H2SO4溶液100μL終止反應(yīng)。

2.5 抗體的純化

選擇HiTrap rProtein A FF 5mL預(yù)裝色譜柱純化抗體。取適量腹水,10 000 r/min離心15 min,取上清,經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾后,用20 mmol/L磷酸緩沖液上樣,用0.1 mol/L檸檬酸緩沖液洗脫。考察選擇上樣緩沖液的pH值和離子強度、洗脫緩沖液的pH值,控制樣品流速。

SDS-PAGE法鑒定單抗純度。分離膠濃度12%,濃縮膠濃度4%,還原狀態(tài)下處理樣品,電泳后以考馬斯亮藍R250染色,然后經(jīng)凝膠成像儀掃描鑒定純度。

3 結(jié) 果

3.1 hCG雜交瘤細胞株的建立

3.1.1 小鼠血清抗體效價檢測 hCG抗原免疫的BALB/c小鼠共6只,眼眶取血檢測效價(表1)。6只小鼠的血清抗體效價都達到了10-7以上,免疫效果較好,可進行細胞融合。

表1 免疫小鼠血清抗體效價Tab.1 Antibody titers in the sera of themiceimmunized with hCG

3.1.2 雜交瘤細胞株的建立 細胞融合后鋪3塊96孔板,經(jīng)HAT培養(yǎng)液篩選后,測出7個陽性孔,取上清效價最高(10-3)的兩孔細胞株(1C1,2G12)單克隆化4次。從表2看出,第2～4次單克隆時,2株細胞的陽性率均為100%。雜交瘤細胞株經(jīng)15周的培養(yǎng)后依舊能穩(wěn)定分泌單克隆抗體。經(jīng)液氮凍存復(fù)蘇后仍能穩(wěn)定分泌抗hCG抗體。

表2 2株雜交瘤細胞株單克隆化實驗結(jié)果Tab.2 Result of hybridoma cell cloning of 2 hybridoma cells

3.2 單克隆抗體的制備及其性質(zhì)的鑒定

3.2.1 雜交瘤細胞上清蛋白含量及抗體效價的檢測 細胞上清抗體效價達到了10-3以上(表3)。

3.2.2 腹水蛋白含量及抗體效價的檢測 2株雜交瘤細胞株注射小鼠腹腔均能產(chǎn)生較高濃度的蛋白,且抗體效價均在10-7以上(表3)。

表3 細胞上清和腹水中的蛋白含量及抗體效價Tab.3 Protein concentration and antibody titer of cell culture supernate and obtained ascites

3.3 抗體的純化

在上樣緩沖液pH 6.5,7.0,7.5和8.0條件下,目的單抗基本保留在色譜介質(zhì)上。在pH 7.0的上樣條件下,洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少,回收率略高。

上樣緩沖液的離子強度為4 mol/L以上時會產(chǎn)生鹽析效應(yīng),影響抗體的穩(wěn)定性。在0～3.0 mol/L NaCl的離子強度下,目的單抗均能較好地與色譜介質(zhì)結(jié)合,在3.0 mol/LNaCl的離子強度下,洗脫的目的蛋白峰中雜蛋白含量較少,回收率較高。

采用pH為3.0的0.1 mol/L檸檬酸緩沖液進行洗脫時,洗脫峰為單一峰,而且峰形較好,洗脫較完全,回收率高。隨著pH的增加,洗脫時間越長,洗脫也越不完全,抗體回收率降低。當(dāng)pH為6時,無明顯的洗脫峰。

樣品在各個流速下進行上樣和洗脫,都可以得到較高的純度和回收率,流速對其影響較小。因此為了提高效率,可以采用5.0mL/min的流速進行上樣和洗脫。

本實驗確定pH 7.0,20 mmol/L磷酸緩沖液+3.0 mol/L NaCl為最佳上樣條件;pH 3.0,0.1 mol/L檸檬酸為最佳洗脫條件。純化后抗體純度達98%以上,回收率達75%。色譜結(jié)果如圖1所示。電泳鑒定結(jié)果如圖2所示。

4 討 論

本文采用hCG免疫BALB/c小鼠,取其脾細胞與小鼠骨艘瘤細胞SP2/0融合,經(jīng)反復(fù)篩選和單克隆化后得到2株穩(wěn)定分泌單克隆抗體細胞株。所獲得的單克隆抗體細胞株為將來有關(guān)早孕、癌癥檢測、激素本身相關(guān)研究及疫苗研制等領(lǐng)域打下基礎(chǔ)。

hCG與來自腦垂體的一些糖蛋白如促黃體生成素(LH)、促卵泡激素(FSH)和促甲狀腺激素(TSH)等結(jié)構(gòu)相似,α鏈的氨基酸排列順序基本相同,而代表hCG特異性的僅是β鏈羧基末端約30個氨基酸的片段。故用完整的hCG分子作為免疫原制備單克隆抗體,或多或少地會和LH、FSH、TSH發(fā)生交叉反應(yīng),抗α-hCG的抗體無法識別α-hCG和甾體糖蛋白之間的差異[7]。因此我們設(shè)想下一步采用新型的基因免疫法來制備針對hCGβ亞基羧基末端 37肽(βhCG-CTP)的單克隆抗體,避免交叉反應(yīng)。

隨著單抗在診斷與治療中應(yīng)用的快速發(fā)展,對單抗的種類及數(shù)量的需求越來越多[8],同時也對相應(yīng)的下游純化技術(shù)提出更高的要求。純化抗體的方法多種多樣,硫酸銨沉淀法純化后的純度很有限;辛酸提取法的操作時間太長,效果也不是很理想;離子交換色譜和凝膠過濾法純化效果不錯,但是過程太繁瑣;疏水色譜能夠影響蛋白的活性,柱子的再生也比較困難。所以尋找具有高效、快速、純度高的純化方法是有重要意義的。

本文采用蛋白A親和色譜純化單抗,僅一次純化即可得到良好的分離效果,獲得純度高,特異性強,生物活性好的單抗,而且這種方法操作簡便,快速(通常在2 h即可完成純化過程),重復(fù)性好,色譜柱可反復(fù)多次使用,為今后單抗用于基礎(chǔ)研究及臨床診療過程中的質(zhì)量控制提供了保證。

[1]楊廷富.人絨毛膜促性腺激素的臨床意義及檢測進展[J].檢驗醫(yī)學(xué)與臨床,2007,4(10):976-978.

[2]Michael G,Gregory W,Annete G,etal.Genetic immunization with the free human chorionic gonadotrophinβsubunit elicit cytotoxic T lymphocyte responses and protectsagainst tumor formation in mice[J].Lab Invest,1997,76(7):859-871.

[3]Manzke O,Tesch H,Diehl V,etal.Single-step purification of bispecific monoclonal antibodies for immunotherapeutic useby hydrophobic interaction chromatography[J].J Immunol Methods,1997,208:65-73.

[4]謝競,石明雋,張國忠,等.不同 pH值和鹽濃度對柱色譜提取抗-D抗體的影響[J].中國生化藥物雜志,2005,26(4):208-210.

[5]Mccue JT,Kemp G,Low D,etal.Evaluation of protein-A chromatography media[J].JChromatogr A,2003,989(1):139-153.

[6]Hahn R,Kazumichi S,Steindl F,etal.Comparison of protein A affinity sorbentsⅢ:Life time study[J].J Chromatogr A,2006,1102(1-2):224-231.

[7]Steven V C,Powell JE,Lee A C,etal.Antifertility effects from immunization of femalebaboons with C-terminal peptidesof human chorionic gnadotropin[J].Fertil Steril,1981,36:98-105.

[8]潘萌,孔蘊,陳暢.單克隆抗體藥物的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2008,29(1):62-64.