李 京,范慧紅

(中國(guó)藥品生物制品檢定所,北京 100050)

2009年1月,我們實(shí)驗(yàn)室參加了第6次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品的協(xié)作標(biāo)定工作。這次國(guó)際協(xié)作標(biāo)定由英國(guó)國(guó)家生物制品檢定所(NIBSC)組織,用第5次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)6個(gè)第6次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品待標(biāo)品進(jìn)行效價(jià)測(cè)定。傳統(tǒng)的肝素效價(jià)測(cè)定方法為凝血法[1-3],這次協(xié)作標(biāo)定鼓勵(lì)參加的實(shí)驗(yàn)室用底物法測(cè)定肝素效價(jià),以比較底物法與凝血法測(cè)定結(jié)果的差異,考慮是否可以用底物法取代凝血法。英國(guó)藥典2009年版收載了半微量生色底物法測(cè)定低分子肝素抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子活性的方法[4]。但該方法需使用大量昂貴的酶反應(yīng)試劑,實(shí)驗(yàn)效率低,不能在短時(shí)間內(nèi)對(duì)多批樣品同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。于是我們對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行了改進(jìn),用微量底物法測(cè)定了6個(gè)肝素待標(biāo)品的活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果誤差小,重復(fù)性良好。

1 儀器與試藥

Spectra MAX190型酶標(biāo)儀,美國(guó)Molecular Devices公司;中國(guó)藥典生物檢定統(tǒng)計(jì)程序BS2000,本所編制。

標(biāo)準(zhǔn)品(S):第五次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào):97/578,效價(jià):2 031 IU/支),凍干品,-20℃保存于安瓿中 ,共 4支 ,每支編號(hào)分別為S1、S2、S3、S4。

供試品(T):第六次肝素國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品待標(biāo)品,共6 個(gè)(編號(hào) T、V、W、X、Y、Z),凍干品,-20 ℃保存于安瓿中,每個(gè)供試品4支,分別編號(hào),如待標(biāo)品T的4 支安瓿編號(hào)分別為T(mén)1、T2、T3、T4。

發(fā)色底 物 S-2765:N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl,相對(duì)分子質(zhì)量(Mr)為714.6、發(fā)色底物S-2238:H-D-Phe-Pip-Arg-pNA·2HCl,M r為625.6、抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ)(10 IU/瓶)、Ⅹa因子(71 nkat/支),均由意大利chromogenix公司生產(chǎn);Ⅱa因子:國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品,批號(hào)140625-200308(供效價(jià)測(cè)定用),580 IU/支,本所制備;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、聚乙二醇6000(PEG6000)為進(jìn)口分裝試劑;其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 方 法

2.1 溶液配制

Tris緩沖液(pH 8.4):取Tris 6.06 g、氯化鈉10.23 g、乙二胺四醋酸二鈉(EDTA-2Na)2.8 g和PEG6000 1 g,加水900mL使溶解,用鹽酸調(diào)節(jié)pH值8.4,加水稀釋至1 000mL。4℃冰箱保存,備用。

發(fā)色底物S-2765溶液:用無(wú)菌水制成0.001 mol/L的溶液,4℃冰箱避光保存。

發(fā)色底物S-2238溶液:用無(wú)菌水制成0.001 25 mol/L的溶液,4℃冰箱避光保存。

ATⅢ溶液:用Tris緩沖液(pH 8.4)制成1IU/mL的溶液和0.125 IU/mL的溶液。

Ⅹa因子溶液:用Tris緩沖液(pH 8.4)制成7.1 nkat/mL的溶液。

Ⅱa因子溶液:用Tris緩沖液(pH 8.4)制成5 IU/mL的溶液。

50%醋酸溶液:冰醋酸50mL加水至100mL。

標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液:標(biāo)準(zhǔn)品與供試品先以純水溶解并稀釋至約100 IU/mL,分裝至1.5mL塑料離心管中,-20℃凍存。臨用前取出,放置至室溫后使用。復(fù)融后的樣品不得再次冷凍。實(shí)驗(yàn)時(shí)用Tris緩沖液(pH 8.4)分別將標(biāo)準(zhǔn)品和供試品溶液稀釋成在log劑量-反應(yīng)的線性范圍內(nèi)的4個(gè)不同濃度的溶液,劑距r=1∶0.7,抗Ⅹa因子活性測(cè)定濃度范圍為0.016 8～0.049 IU/mL;抗Ⅱa因子活性測(cè)定濃度范圍為0.010 1～0.024 IU/mL。

2.2 抗Ⅹa因子活性測(cè)定

在96孔酶標(biāo)板上加樣,標(biāo)準(zhǔn)品和供試品每個(gè)濃度平行做兩孔,可以同時(shí)測(cè)定3個(gè)供試品,實(shí)驗(yàn)時(shí)可參照表1的順序排列。每孔分別加入4種濃度的S或T稀釋液25μL,及1 IU/mL的ATⅢ溶液25μL,置于酶標(biāo)儀中混勻(不得產(chǎn)生氣泡),并在37℃保溫2 min。每管加Ⅹa因子溶液50μL(可根據(jù)空白試驗(yàn)結(jié)果調(diào)整),混勻,37℃保溫2 min,加發(fā)色底物S-2765溶液50μL,混勻,37 ℃保溫2 min后,加50%醋酸溶液50μL終止反應(yīng)。在405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定每孔的吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)前以Tris緩沖液(pH 8.4)代替T同法操作作為空白對(duì)照,可以適當(dāng)調(diào)整加入的Ⅹa因子溶液的體積,使空白的A值在0.6～0.9之間。實(shí)驗(yàn)中,所用試劑在冰浴中保存。以A值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品或供試品溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別作線性回歸,按生物檢定統(tǒng)計(jì)法[1]中的量反應(yīng)平行線原理4×4法完全隨機(jī)或隨機(jī)區(qū)組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),回歸關(guān)系應(yīng)非常顯著(P＜0.01),標(biāo)準(zhǔn)品和供試品回歸直線相互平行,偏離平行不顯著(P＞0.05),二次曲線、反向二次曲線不顯著(P＞0.05),實(shí)驗(yàn)可靠性測(cè)驗(yàn)通過(guò)者計(jì)算效價(jià)和95%概率水平的誤差范圍(FL%)。

2.3 抗Ⅱa因子活性測(cè)定

除加入ATⅢ溶液濃度改為0.125 IU/mL、50 μL,Ⅹa因子溶液改為5 IU/mL Ⅱa因子溶液,發(fā)色底物改為加入S-2238溶液25μL外,實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、步驟及數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)同抗Ⅹa因子測(cè)定,Ⅱa因子溶液加入的體積也可根據(jù)空白試驗(yàn)適當(dāng)調(diào)整。

3 結(jié)果與討論

用4 d時(shí)間分別測(cè)定了6個(gè)待標(biāo)品的抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效價(jià),每個(gè)待標(biāo)品測(cè)定了4支,實(shí)驗(yàn)順序如表1。

表1 實(shí)驗(yàn)順序Tab.1 Order of testing

6個(gè)待標(biāo)品效價(jià)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2和3。每個(gè)待標(biāo)品4次測(cè)定結(jié)果的平均值以幾何平均值計(jì)算,單次實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)誤差以95%概率水平的可信限率(FL%)表示,4次測(cè)定結(jié)果誤差以幾何變異系數(shù)(geometric coefficient of variation,gcv)表示,gcv的計(jì)算參照文獻(xiàn)[5]?？梢钥闯?1次實(shí)驗(yàn)同時(shí)測(cè)定3批樣品效價(jià),實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以通過(guò)實(shí)驗(yàn)可靠性檢測(cè),可信限率小于15%,4次測(cè)定的誤差均小于10%,實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

表2 肝素待標(biāo)品抗Ⅹa因子效價(jià)(IU/支)測(cè)定結(jié)果Tab.2 The results of the assay for anti-FⅩa potencies(IU/ampoule)of candidates

表3 肝素待標(biāo)品抗Ⅱa效價(jià)(IU/支)測(cè)定結(jié)果Tab.3 The results of the assay for anti-FⅡa potencies(IU/ampoule)of candidates

英國(guó)藥典使用的半微量生色底物法[4]反應(yīng)總體積在1mL左右,反應(yīng)在小管中進(jìn)行,用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度,1次反應(yīng)時(shí)間約30 min,一般1次只能測(cè)定1批樣品的效價(jià)。該方法實(shí)驗(yàn)效率低,需使用大量酶反應(yīng)試劑,實(shí)驗(yàn)成本高。我們?cè)谠摲椒ǖ幕A(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),將半微量生色底物法改為微量生色底物法,使反應(yīng)總體積降至200μL,反應(yīng)在96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行,用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品吸光度,1次反應(yīng)時(shí)間約為10 min,1次實(shí)驗(yàn)可以同時(shí)測(cè)定3批樣品的效價(jià),實(shí)驗(yàn)結(jié)果良好。微量生色底物法使實(shí)驗(yàn)效率得到了很大提高,并且節(jié)省了昂貴的酶反應(yīng)試劑,降低了檢驗(yàn)成本。

酶反應(yīng)實(shí)驗(yàn)易受反應(yīng)濃度、試劑活力、環(huán)境等因素影響,降低了反應(yīng)體積后,實(shí)驗(yàn)操作需更加小心,以減少實(shí)驗(yàn)誤差。

在這次國(guó)際協(xié)作標(biāo)定中,我們實(shí)驗(yàn)室還用中國(guó)藥典兔全血法[1]、美國(guó)藥典羊血漿法[2]、英國(guó)藥典APTT法[3]測(cè)定了待標(biāo)品的效價(jià),與底物法測(cè)定的結(jié)果一起報(bào)告了NIBSC。2009年6月,我們收到NIBSC給參加實(shí)驗(yàn)室的協(xié)作標(biāo)定報(bào)告。共有18個(gè)國(guó)家的34個(gè)實(shí)驗(yàn)室參加了這次協(xié)作標(biāo)定,用底物法測(cè)定待標(biāo)品抗Ⅹa因子和抗Ⅱa因子效價(jià)的實(shí)驗(yàn)室分別有24個(gè)和18個(gè),結(jié)果分別見(jiàn)表2和表3,我所與NIBSC的結(jié)果基本一致。這次國(guó)際協(xié)作標(biāo)定的其他情況,將另文報(bào)告。

[1]中國(guó)藥典[S].二部.2005:附錄102-附錄103.

[2]USP[S].32.2008:2553-2554.

[3]BP[S].2008:990-991.

[4]BP[S].2008:992-993.

[5]ThomasK.Geometric means and measure of dispersion[J].Biometrics,1979,35(10):908-909.