楊 劍,朱 姝,才 蕾,田 ,姚文兵

(中國藥科大學 生命科學與技術(shù)學院,江蘇,南京 210009)

聚乙二醇化(PEGylation)又稱為PEG修飾,是目前分子變構(gòu)化學中最重要的技術(shù)之一。單甲氧基聚乙二醇經(jīng)過活化帶上親電基團,可以與蛋白質(zhì)分子上的親核基團(如自由氨基和末端氨基)共價結(jié)合進行修飾[1-3]。PEG修飾不僅可以增加蛋白質(zhì)的水溶性,還能減少腎臟的清除,優(yōu)化蛋白質(zhì)的藥代動力學和藥效學性質(zhì),克服蛋白質(zhì)類藥物在臨床應用中的困難,因而在蛋白質(zhì)類藥物的開發(fā)中得到了廣泛的應用[4-5]。

尿酸酶(Urate Oxidase,Uricase,EC 1.7.3.3)是生物體內(nèi)嘌呤降解代謝途徑中的一種酶,催化尿酸氧化為水溶性較高的尿囊素排出體外[6]。尿酸酶在治療頑固性痛風及高尿酸血癥方面有很好的效果[7-8],但由于免疫原性較高,易引起過敏反應等使其臨床應用受到了一定限制。而PEG修飾可以克服這些缺點,因而PEG化尿酸酶的研究越來越受到重視。

本文著重考察尿酸酶和PEG化尿酸酶的體內(nèi)外穩(wěn)定性差異,并比較修飾前后尿酸酶在小鼠體內(nèi)半衰期的變化,為PEG化尿酸酶的開發(fā)提供參考。

1 材 料

PEG化尿酸酶、尿酸酶(工程菌pBV220-Uricase/DH5α表達),自制;尿酸、胰蛋白酶、活性檢測液(1 mmol/L DHBS,0.2 mol/L Na3PO4,0.25 mmol/L 4-AAP,25 U/mL HRP),Sigma公司,其余均為國產(chǎn)分析純試劑。

BALB/c小鼠(清潔級,雄性,25 g),揚州大學比較醫(yī)學研究中心,合格證號:SCXK(蘇)2009-0004。

752 型紫外光柵分光光度計,上海第三分析儀器廠;MK3全波長酶聯(lián)免疫檢測儀(Thermo Electron Corporation)。

2 方 法

2.1 尿酸酶活性測定

尿酸酶活性測定反應體系為pH 8.4,0.1 mol/L硼酸-硼砂緩沖液,以0.001%尿酸為底物,25℃反應5 min,每隔30 s在293 nm波長處測定1次吸光度值。酶活單位定義為:每1 min催化1μmol底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。

2.2 熱穩(wěn)定性研究

分別取1mg/mL尿酸酶和PEG化尿酸酶溶液,于4～80℃條件下水浴30 min,取出靜置至25℃,按照2.1項方法測定酶活性。結(jié)果以活性保留百分數(shù)表示。

2.3 酸堿穩(wěn)定性

分別將尿酸酶與PEG化尿酸酶透析置換于下列緩沖體系中:0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液(pH 3.6,4.0,5.2);0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.0,6.8);0.1mol/L硼酸緩沖液(pH 7.6,8.4);0.1 mol/L甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液(pH 9.2,10.0),4℃放置24 h。調(diào)節(jié)pH至8.5,按照2.1項方法測定活性。結(jié)果以活性保留百分數(shù)表示。

2.4 抗胰蛋白酶水解能力

配制1mg/mL的胰蛋白酶溶液,緩沖體系為pH 8.4,0.1 mol/L硼酸緩沖液,將胰蛋白酶溶液與1mg/mL尿酸酶和1mg/mL PEG化尿酸酶分別按照5∶1的比例混合,37℃溫育,定時取樣,按2.1項方法測定酶活性。結(jié)果以活性保留百分數(shù)表示。

2.5 小鼠體內(nèi)半衰期的測定

取BALB/c小鼠12只,隨機分為2組,每組6只。兩組小鼠分別尾靜脈注射尿酸酶和PEG化尿酸酶0.2mg/kg,并于給藥后10,30,60,120 min以及4,6,10,24 h眼眶取血。按常規(guī)分離血清,于-20℃保存待測。

取血清20μL用pH 8.4,0.1 mol/L的硼酸緩沖液200μL稀釋后,取100μL加入酶標板,再加入0.01%尿酸底物溶液80μL和活性檢測液100μL,反應20 min后,在570 nm波長處測定吸光度值[9]。

3 結(jié) 果

3.1 熱穩(wěn)定性

尿酸酶和PEG化尿酸酶對溫度的穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出PEG化尿酸酶在4～60℃范圍內(nèi)是穩(wěn)定的,而尿酸酶在40℃時,酶活降至最高值的70%。超過60℃時,PEG化尿酸酶及尿酸酶活性均迅速降低。

圖1 PEG化尿酸酶及尿酸酶的溫度穩(wěn)定性Fig.1 Thermal stability of PEG-uricase and native uricase

3.2 酸堿穩(wěn)定性

尿酸酶和PEG化尿酸酶對酸堿的穩(wěn)定性試驗結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,pH 5.2～6.0及pH 9.2～10.0之間,尿酸酶活性迅速降低,而在這一pH范圍內(nèi),PEG化尿酸酶保留了較高的活性。

圖2 PEG化尿酸酶和尿酸酶的pH穩(wěn)定性Fig.2 pH stability of PEG-uricase and nativeuricase

3.3 抗胰蛋白酶水解能力

結(jié)果見圖3。PEG化尿酸酶比尿酸酶有更好的抗胰蛋白酶降解的能力。尿酸酶在胰蛋白酶作用下100 min后活性降至50%,在作用200 min后活性降至20%;而PEG化尿酸酶在200 min后仍保留70%的活性。

3.4 小鼠體內(nèi)半衰期的測定

隨著PEG化尿酸酶及尿酸酶經(jīng)尾靜脈注射至小鼠體內(nèi),其活性隨著時間逐漸降低,結(jié)果如圖4。經(jīng)藥代動力學軟件進行房室模型擬合及藥代動力學參數(shù)計算,PEG化尿酸酶的血漿半衰期為1530 min,而尿酸酶半衰期為45 min。

圖3 PEG化尿酸酶和尿酸酶的抗胰蛋白酶水解能力Fig.3 Resistanceto proteolysis of PEG-uricase and uricase

圖4 PEG化尿酸酶和尿酸酶在小鼠體內(nèi)的消除速率Fig.4 Circulation half-lifetimeof PEG-uricase and uricase in vivo

4 討 論

經(jīng)過PEG修飾,尿酸酶的體內(nèi)外穩(wěn)定性有較大幅度的提高。在體外試驗中,PEG化尿酸酶顯示了不同于尿酸酶的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性。值得關(guān)注的是,酸堿穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示,PEG化尿酸酶在其等電點附近較好的保留了活性,而尿酸酶在等電點附近活性明顯下降。推測可能是由于PEG的親水鏈阻止了蛋白質(zhì)在等電點處的聚集,因而提高了穩(wěn)定性?？挂鹊鞍酌杆饽芰Φ奶岣?則可能是由于聚乙二醇在尿酸酶分子表面的空間位阻作用,使蛋白的活性部位和維持構(gòu)象的次級鍵免受酶水解破壞,從而提高了其抗蛋白酶水解的能力。

在臨床使用中,尿酸酶需要每天注射,不僅是尿酸酶,大多數(shù)蛋白質(zhì)藥物的半衰期都非常短,這是由于蛋白質(zhì)能輕易的被腎小球濾過,并且蛋白水解作用也縮短了藥物半衰期。經(jīng)過PEG修飾可以很好的解決上述問題,如PEG修飾可以增加蛋白質(zhì)藥物的相對分子質(zhì)量,增大的流體半徑可以減少腎小球的濾過;此外,PEG修飾蛋白質(zhì)藥物也可以遮蔽蛋白水解酶的水解位點來增強其抗酶解能力。本研究證明,尿酸酶經(jīng)PEG修飾,其半衰期由原來的45 min增至1 530 min。因此,用PEG修飾尿酸酶是提高尿酸酶生物半衰期的有效方法。

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