孫艷華,董 哲,高成生

(遼寧醫(yī)學院 第一附屬醫(yī)院 普外科/大腸病區(qū),遼寧 錦州 121001)

Sugarbaker提出的術后早期腹腔化療理論(early postoperative intraperitoneal chemotherapy,EPIC)較傳統(tǒng)的腹腔化療對預防結直腸癌術后手術創(chuàng)面、腹膜和肝臟轉移具有更重要的意義[1]。臨床研究表明,EPIC可降低局部復發(fā)率,延長患者的生存期[2]。但 EPIC也有增加術后并發(fā)癥的風險,其中吻合口漏、腹腔膿腫和化學性腹膜炎比較常見,這也成為其廣泛臨床開展的主要障礙[3]。銅綠假單胞菌注射液(PA-MSHA)是一種生物工程技術制備的新型菌類制劑[4],不但能直接誘導腫瘤細胞凋亡[5],還能有效激活人體免疫系統(tǒng)[6],已廣泛用于多種惡性腫瘤的輔助治療。PA-MSHA能夠有效防止腫瘤術后的轉移和復發(fā)[7],降低感染發(fā)生率,延長患者的生存期[8]。為研究 PA-MSHA能否促進術后早期腹腔化療情況下結腸吻合口的愈合,我們利用SD大鼠的結腸切除吻合模型對此進行了研究。

1 材料和方法

1.1 大鼠結腸吻合模型的建立

雄性 SD大鼠 60只,體重 200～250 g,由遼寧醫(yī)學院實驗動物中心提供,合格證號:SYXK(遼)2009-0011。大鼠術前禁食 12 h,飲水不限。術前稱體重,10%水合氯醛3mL/kg腹腔內麻醉,于劍突下1cm處取長約3cm腹正中切口,逐層切開入腹,切除1cm左結腸,5-0的無損傷線間斷內翻縫合8～10針,1號絲線縫合腹膜、腹部肌肉和皮膚。術后12 h開始給予常規(guī)鼠飼料,術后24 h開始給藥。

1.2 實驗分組及給藥方法

大鼠隨機分成3組:A組,術后1～5d腹腔注射生理鹽水0.8mg/(kg·d);B組,術后1～5d腹腔內注射 5-氟尿嘧啶(5-Fu)20mg/(kg·d);C組,術前第3天開始雙后肢內側皮下注射 PA-MSHA(北京萬特爾生物制藥有限公司)0.5mL/次,隔日一次,直至處死或實驗結束,術后腹腔化療方法同B組。各組大鼠均不使用抗生素。

1.3 檢查指標及方法

1.3.1 一般情況 造模及給藥過程中,密切觀察并記錄各組大鼠的飲食情況、活動、精神狀態(tài)和腹部切口愈合情況等。

1.3.2 吻合口漏發(fā)生率 對治療期間死亡的大鼠進行尸檢,明確其死亡原因。各組大鼠分別于術后第7和14天,各取10只進行開腹探查,如腹腔內有大量滲出液,吻合口與周圍組織及網膜有不同程度粘連,松解粘連,吻合口周圍發(fā)現(xiàn)膿苔、組織壞死或明顯漏口者可判定為吻合口漏,計算各組吻合口漏的總發(fā)生率。

1.3.3 淋巴細胞計數 各組大鼠分別于術后第7和14天開腹抽取下腔靜脈血3mL,進行淋巴細胞計數。

1.3.4 吻合口破裂壓力(ABP) 大鼠開腹后,在吻合口遠近兩端各3cm結扎腸襪,一端腸襪與壓力換能器連接,另一端與微量輸液泵連接,通過 LMS-2B型二道生理記錄儀記錄壓力曲線。以輸液泵向腸管內注入生理鹽水2mL/min,觀察壓力曲線急驟下降前的最大壓力即 ABP。

1.3.5 吻合口羥脯氨酸(HYP)含量 清除吻合口周圍粘連組織,切取以吻合口處組織50～100mg,-80°C冰箱保存待檢,分別按考馬斯亮蘭蛋白試劑盒和HYP試劑盒說明操作。

1.3.6 病理組織學觀察 取吻合口處組織,10%中性甲醛液內固定,常規(guī)石蠟包埋、切片層厚 5μm,行蘇木精-伊紅染色和免疫組織化學染色后進行顯微鏡下觀察,免疫組織化學染色并做圖像分析,結果取像素和面積平均后的乘積。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 一般情況

各組大鼠在術后6h基本恢復活動力,12 h恢復飲食。術后2～7d,B組較其他兩組活動力下降,表現(xiàn)為倦怠,飲食減少,對刺激反應遲鈍,術后8d基本恢復。各組大鼠均無腹壁切口感染發(fā)生。

2.2 吻合口漏發(fā)生率

術后各組大鼠腹腔均有不同程度的粘連,以B組最為明顯。A組和C組均無吻合口漏發(fā)生,B組共發(fā)生 6例吻合口漏,其中術后第4天2例、第5天3例、第7天1例,大鼠均死亡。解剖發(fā)現(xiàn)大鼠均發(fā)生腹腔感染積液甚至腹腔膿腫。B組吻合口漏發(fā)生率為30%,顯著高于A組和C組的0(P＜0.01)。

2.3 外周血淋巴細胞計數、ABP和HYP測定結果

結果見表1。術后第7天,B組外周血淋巴細胞計數顯著低于A組(P＜0.05)和C組(P＜0.01)。術后第14天,C組外周血淋巴細胞計數顯著高于另外兩組(P＜0.01)。術后第7天,B組ABP和HYP含量均明顯低于A組和C組(P＜0.01)。術后第14天,3組之間 ABP和HYP含量比較均無顯著差異(P＞0.05)。

表1 外周血淋巴細胞計數、ABP和HYP測定結果(±s)Tab.1 Determination results of in peripheral blood lymphocyte count,ABP and HYP(±s)

表1 外周血淋巴細胞計數、ABP和HYP測定結果(±s)Tab.1 Determination results of in peripheral blood lymphocyte count,ABP and HYP(±s)

與B組比較:1P＜0.05,2P＜0.01;與C組比較:3 P＜0.01Compared with B group:1 P＜0.05,2P＜0.01;Compared with C group:3 P＜0.01

組別 n 淋巴細胞計數/(109/L)術后7天術后14天ABP/(mmHg)術后7天術后14天HYP/(μg/mgprot)術后7天術后14天A組 10 5.11±0.651 12.09±0.833 132.19±2.551,3 135.92±0.56 3.46±0.371,3 4.06±0.21 B組 7 2.94±2.40 12.04±0.693 92.11±14.40 134.84±2.16 2.81±0.30 3.89±0.19 C組 10 6.49±1.682 18.43±2.65 129.93±5.781 135.73±0.94 3.40±0.301 4.05±0.20

2.4 病理學觀察

2.4.1 吻合口細胞浸潤和愈合情況 術后第7天,吻合口組織切片HE染色,觀察結果顯示,B組吻合口組織炎癥細胞、成纖維細胞、新生血管均較少,周圍黏膜壞死明顯且組織疏松;而A組和C組吻合口組織炎癥細胞、成纖維細胞、新生血管較多,黏膜壞死脫落相對較輕,各組織也較為致密(圖1)。術后第14天,各組吻合口組織更為致密,新生黏膜上皮覆蓋,滲出的炎癥細胞減少,局部以成纖維細胞為主,新生血管閉合,3組吻合口均愈合良好(圖2)。

圖1 術后第7天吻合口組織HE染色(200×)Fig.1 HE staining of Anastomotic on the 7th day after surgery(200×)

圖2 術后第14天吻合口組織HE染色(200×)Fig.2 HEstaining of Anastomotic on the 14th day after surgery(200×)

2.4.2 吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原表達情況 免疫組織化學染色結果顯示,Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維呈棕黃色顆粒狀或片狀,顯色在成纖維細胞胞漿和膠原特定的區(qū)域,且在瘢痕組織中表達更為明顯。術后第7天,B組吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維細小且紊亂,而A和C組則粗大且規(guī)則;A和C組之間膠原的含量沒有差異(P＞0.05),但均顯著高于B組(P＜0.05)(表2)。術后第14天,3組吻合口Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維更加致密,但 3組之間含量已經沒有顯著差異(P＞0.05)(表2)。

3 討 論

PA-MSHA的有效成分是滅活的銅綠假單胞菌-甘露糖敏感血凝菌毛株,其區(qū)別于自然界銅綠假單胞菌的最顯著結構特點是具有周身的甘露糖敏感血凝(MSHA)菌毛[4]。最新研究表明,PA-MSHA的MSHA菌毛能夠與腫瘤細胞表面 EGFR受體上的甘露糖結合,進而阻斷 EGFR受體的活化,抑制腫瘤細胞的生長并誘導其發(fā)生凋亡[5]。另一方面,PAMSHA的菌體成分,如 MSHA菌毛能夠激活包括TLR4在內的模式識別受體(PRR)[9],活化多種免疫細胞,如樹突狀細胞、巨噬細胞、T細胞和NK細胞,幫助機體重建免疫監(jiān)視和免疫防御功能[6]。

本研究選用目前公認為腹腔化療最有效、最常用的化療藥物——5-Fu,以Sugarbaker提出的EPIC理論為依據,從術后24 h開始,連續(xù) 5 d腹腔內注射5-Fu。研究發(fā)現(xiàn),B組的吻合口漏多發(fā)生在術后4～5d。既往的研究表明,在吻合術后3～4 d內,吻合口區(qū)域膠原酶被激活,膠原合成少于膠原降解導致膠原含量減少,吻合口抗張強度明顯下降,這一時期最易于發(fā)生吻合口漏。由于大鼠腹腔注射 5-Fu且術后未使用抗生素,5-Fu嚴重阻礙新生膠原纖維的合成,同時 5-Fu抑制機體免疫導致腹腔感染的發(fā)生,也阻礙了膠原纖維合成,使結腸吻合口漏在B組發(fā)生例數最多。術后第7天,B組淋巴細胞計數、ABP、HYP較低;顯微鏡下炎癥細胞、成纖維細胞、新生血管均較少,周圍黏膜壞死明顯;Ⅰ型和Ⅲ型膠原纖維面積較小且紊亂、細小。而C組由于預防性注射 PA-MSHA,拮抗 5-Fu腹腔化療對大鼠免疫系統(tǒng)的直接抑制作用,激活 T細胞、巨噬細胞等多種免疫細胞,研究表明免疫細胞可分泌一系列的細胞因子,不僅能促進成纖維細胞增殖合成膠原纖維,還可以刺激血管內皮增殖,促進新生毛細血管生成,調節(jié)組織修復的全過程[10];另外 PA-MSHA通過誘導大鼠機體產生高效價的跨菌屬抗體,增強機體免疫防御功能,有效地預防腹腔感染的發(fā)生,所以吻合口愈合良好。術后第14天,大鼠體內 5-Fu完全代謝,各項指標恢復與A組無明顯差異,但腹腔粘連明顯重于A組和C組,而腹腔粘連在慢性腸梗阻的發(fā)病機制中占有重要地位;C組只有淋巴細胞計數仍高于A組和B組,其他指標無明顯差異,可見 PA-MSHA并沒有導致大鼠吻合口產生過度炎癥反應,形成局部纖維瘢痕,造成吻合口狹窄。這是因為組織修復過程是各種免疫細胞及分泌的多種細胞因子共同作用的結果,其中既有促進愈合的作用也有抑制愈合的作用。研究發(fā)現(xiàn)這些細胞因子之間存在著復雜的相互作用,如巨噬細胞除了分泌TGF-β1和TGF-β2外,也能分泌 TGF-β3,而TGF-β3可下調 TGF-β1和TGF-β2,從而起到抗瘢痕修復的作用[11]。

總之,本研究發(fā)現(xiàn) PA-MSHA可以減輕術后早期腹腔化療對吻合口愈合的不良影響,降低吻合口漏的發(fā)生率。因此,提示 PA-MSHA皮下注射作為一種結、直腸癌的輔助治療方法,不但能在術后降低腫瘤的轉移和復發(fā),還能促進吻合口的愈合。

表2 吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量測定結果(±s)Tab.2 Determination results ofⅠ,Ⅲ collagen fiber content in anastomotic(±s)

表2 吻合口Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維的含量測定結果(±s)Tab.2 Determination results ofⅠ,Ⅲ collagen fiber content in anastomotic(±s)

與B組比較:1P＜0.05Compared with B group:1 P＜0.05

C組 10 1.44±0.071 2.55±0.08 1.38±0.111 2.24±0.08

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