沈三英,蔡怡芳,盧橋發(fā)

(1.武漢市普愛醫(yī)院呼吸內(nèi)科,湖北 武漢 430034;2.湖北省陽新縣第三醫(yī)院,湖北 陽新 435000)

近年研究表明 ,轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)在肺纖維化進(jìn)程中起重要作用,其中關(guān)鍵環(huán)節(jié)是能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞,分泌多種細(xì)胞因子,導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)的沉積[1]。核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)通過調(diào)控多種因子的基因表達(dá)而調(diào)控肺纖維化的進(jìn)程[2]。本研究觀察NF-κB抑制劑小白菊內(nèi)酯(Parthenolide,PNT)對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

健康清潔級雄性 SD大鼠由武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動物中心提供,體重 180～220 g,合格證號:SYXK(鄂)2006-0017。

RPMI 1640培養(yǎng)基、小牛血清(美國 Gibco公司);TGF-β1(美國 Peprotech公司 ),α-SMA單抗(北京中山公司),胰蛋白酶(美國 Ameresco公司)。

PNT(美國 Sigma公司),以DMSO溶液配成100 mmol/L并保存于30℃,臨用時(shí)配成20nmol/L的終濃度[3]。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)氣管內(nèi)一次性滴注博萊霉素5mg/kg后14d,處死大鼠,低溫下取出肺臟,采用組織塊法原代培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞,傳代純化細(xì)胞,第4代成纖維細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組細(xì)胞分成對照組、TGF-β1組、低劑量 PNT組和高劑量 PNT組。將第4代成纖維細(xì)胞以1×104的濃度接種于24孔培養(yǎng)板內(nèi)的蓋玻片上,待細(xì)胞均勻貼附后,分別加藥。對照組:更換培養(yǎng)基;TGF-β1組:加含10 μg/L TGF-β1的培養(yǎng)基 ;低劑量 PNT組:分別加含10μg/L TGF-β1和20 μmol/L PNT的培養(yǎng)基;高劑量 PNT組:分別加含10 μg/L TGF-β1和50 μmol/L PNT的培養(yǎng)基。

1.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)染色法檢測平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscle actin,α-SMA) 計(jì)數(shù)細(xì)胞爬片α-SMA免疫陽性細(xì)胞,運(yùn)用多視野參數(shù)統(tǒng)計(jì)模塊對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,獲得平均積分吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

結(jié)果見表1、圖1。TGF-β1組α-SMA陽性率和平均吸光度值均明顯高于對照組,PNT能部分拮抗TGF-β1的作用。

表1 α-SMA陽性細(xì)胞百分率和平均積分吸光度值比較

圖1 低 PNT組α-SMA免疫細(xì)胞化學(xué)染色陽性細(xì)胞(×200)

3 討 論

在肺纖維化進(jìn)程中,NF-κB的過度激活是引起炎癥反應(yīng)及炎癥損傷的關(guān)鍵因素,可促進(jìn)多種促炎因子的釋放而加重肺纖維化。其中,TGF-β1是一種重要的促炎細(xì)胞因子,是誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白α-SMA的最重要的細(xì)胞因子。PNT是從草本類植物艾菊中提取出來的一種倍半萜稀內(nèi)酯化合物,近年來被證實(shí)是NF-κB的一種特異性抑制劑[4]。

本研究選擇 PNT抑制成纖維細(xì)胞的NF-κB激活,觀察其對TGF-β1誘導(dǎo)的大鼠肺成纖維細(xì)胞表達(dá) α-SMA的影響。結(jié)果顯示,TGF-β1組的陽性細(xì)胞百分率(53.5±7.6)%和平均積分吸光度值(36.4±4.9)均明顯高于對照組(P＜0.05),證實(shí)TGF-β1能夠誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞表達(dá) α-SMA。低劑量 PNT組的陽性細(xì)胞百分率和平均積分吸光度值低于TGF-β1,但仍高于對照組;高劑量 PNT組的陽性細(xì)胞百分率和平均積分吸光度值與TGF-β1組無顯著差異,提示 20μmol/L PNT能部分拮抗、50 μmol/L PNT可完全拮抗 TGF-β1的誘導(dǎo)作用。

[1]雷豐豐,趙健雄,王學(xué)習(xí),等.紅芪總多糖對大鼠肺纖維化及其轉(zhuǎn)化生長因子 β1-干預(yù)的實(shí)驗(yàn)觀察[J].中藥材,2008,31(6):873-877.

[2]林箐,倪蓮芳,任雅麗,等.PPARγ和NF-κB在肺纖維化中的表達(dá)與意義[J].北京大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2009,41(5):545-547.

[3]湯霞靖,姚克,葉盼盼,等.小白菊內(nèi)酯對氧化應(yīng)激誘導(dǎo)人晶狀體上皮細(xì)胞凋亡的防護(hù)作用[J].眼科研究,2007,25(11):854-857.

[4]吳雪梅,劉霞,王琛,等.核因子-κB特異性抑制劑小白菊內(nèi)酯在大鼠心肌組織的藥效時(shí)間[J].中國生化藥物雜志,2009,30(6):365-367.