秦倩茹，高宏偉，馬洪明，*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東青島266002）

過敏原小麥醇溶蛋白的ELISA定量檢測方法的建立

秦倩茹1，高宏偉2，馬洪明1，*

（1.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003；2.山東出入境檢驗檢疫局技術中心，山東青島266002）

建立了檢測小麥過敏原醇溶蛋白的定量ELISA抗體夾心法，以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白單抗包被酶標板，HRP標記兔抗醇溶蛋白抗體作為酶標抗體，工作濃度為1∶8000，將醇溶蛋白精確配制成一定濃度的標準品，檢測醇溶蛋白的含量。最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2≥0.99，定量檢測限為19.53ng/mL，對應的食品樣品檢測限為7. 81ppm。樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，實驗內CV為3.07%～5.91%，實驗間CV為0.26%～5.24%，僅對大麥有一定的交叉反應，可在4℃放置兩周。本法準確度和精密度高，重復性和穩(wěn)定性好，特異性較強，適用于食品過敏原小麥醇溶蛋白的檢測。

醇溶蛋白，ELISA，定量檢測

醇溶蛋白（gliadin）是分子量28～55kDa的單體蛋白質，是小麥蛋白的主要成分，占蛋白總含量的40%，主要以貯藏蛋白形式存在于小麥胚乳中，溶于60%～70%的乙醇。在低pH條件下，根據(jù)在電泳圖譜上的遷移率不同，主要分為α-、β-、γ-和ω-四種類型，它們分別占醇溶蛋白總量的25%、30%、30%和15%［1］。根據(jù)完全和部分氨基酸序列分析，它們能分為四組不同的類型：ω5-、ω1，2-、α/β-和γ-醇溶蛋白［2］。醇溶蛋白是小麥等谷物類的主要過敏原，小麥過敏會影響皮膚、內臟、呼吸道的健康，引起運動激發(fā)過敏癥、職業(yè)哮喘、鼻炎、接觸性蕁麻癥、乳糜瀉腸炎、麻風皮膚病等［1］。乳糜瀉腸炎是遺傳易感患者攝入小麥麩質后不能耐受所致的慢性小腸吸收不良綜合癥，并且目前認為醇溶蛋白是乳糜瀉患者的主要誘因。Codex Alimentarius（Alinorm 08/31/26）定義無麩食品為麩質含量低于20ppm的食品，而醇溶蛋白約占麩質含量的一半，所以檢測醇溶蛋白的含量應低于10ppm。因此，需要建立一種有效檢測過敏原醇溶蛋白的方法，檢測食品中醇溶蛋白的含量，既符合美國《食物過敏原標簽及消費者保護法》的要求，也為患者健康提供保障。本文針對醇溶蛋白含量建立了ELISA雙抗體夾心定量快速檢測方法，并對該方法進行了初步驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醇溶蛋白、TMB底物、HRP標記兔抗醇溶蛋白抗體、HRP標記羊抗鼠IgG SIGMA公司；鼠抗醇溶蛋白單克隆抗體 德國ZEDIRA公司；牛血清蛋白BSA Solarbio公司；酪蛋白胨 青島海博公司；特級胎牛血清FBS 北京元亨圣馬公司；其他化學試劑 均為分析純。

恒溫培養(yǎng)箱 上海躍進醫(yī)療器械廠；酶聯(lián)檢測儀（BIO-RAD 680）。

1.2 實驗樣品的前處理［3］

樣品依次為：富凱小麥胚芽，宏光麥仁，宏光小麥，宏光大麥，宏光燕麥米，宏光燕麥片，宏光蕎麥米，宏光長粒糯米，宏光圓粒糯米，宏光黑香米，宏光薏仁米，宏光大黃米，宏光西米，宏光糙米，宏光高粱米，宏光玉米面，君盛爽滑蛋面。

將樣品研磨成細粉，精確稱取100mg，溶于1mL 65%的乙醇，即按照1∶10稀釋。混勻，4℃過夜提取醇溶蛋白，4000r/min離心20min，取上清，上清用樣品稀釋液（即封閉液）稀釋一定倍數(shù)，用于雙抗體夾心ELISA檢測。

醇溶蛋白標準品的配制：取SIGMA公司的粗提麥醇溶蛋白100mg，溶于100mL 65%的乙醇，溶解成1mg/mL的母液，分裝凍存。母液用樣品稀釋液精確稀釋成所需的濃度。

1.3 包被抗體和酶標抗體的最適濃度的確定

首先以ELISA直接法做單因素實驗，分別初步測定包被抗體和酶標抗體的工作濃度，然后按照單因素實驗的結果，選擇適當?shù)陌豢贵w濃度和酶標抗體濃度，按照方陣滴定法，設置陽性對照（10000ng/mL醇溶蛋白標準品）和陰性對照（0ng/mL醇溶蛋白標準品），進一步確定包被抗體和酶標抗體的最適濃度。

1.4 封閉液的選擇

根據(jù)確定的包被抗體和酶標抗體濃度，選擇不同配方的封閉液，主要是以胎牛血清、牛血清蛋白、酪蛋白和蔗糖為主，溶解在0.01mol/L pH7.4的PBS或加入Tween20的PBS中的不同組合的封閉液。分別設置陽性對照和陰性對照，以陰性值小于0.1、陽性對照和陰性對照比值（P/N）最大者為合適的封閉液。

1.5 ELISA雙抗體夾心法

1.5.1 包被 用包被液（0.05mol/L pH9.6碳酸鹽緩沖液）將鼠抗醇溶蛋白單抗稀釋至包被濃度，以100μL/孔加入酶標板中，置4℃過夜。

1.5.2 洗板 棄去酶標板孔內液體，用PBS/T20洗板3次，每次3min，拍干。

1.5.3 封閉 用濃度為10%的FBS-PBS/T20封閉游離結合位點，每孔100μL，37℃溫育1h，洗板。

1.5.4 加入待測抗原 用樣品稀釋液將醇溶蛋白母液作梯度稀釋，待測樣品作適當稀釋，每孔100μL，并設陽性對照和陰性對照，37℃溫育1h，洗板。

1.5.5 加入酶標抗體 將酶標記兔抗醇溶蛋白抗體稀釋至工作濃度，每孔加100μL，新鮮配制，37℃溫育45～60min。

1.5.6 顯色 各孔加TMB（3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺）底物液100μL，室溫避光反應10～15min。

1.5.7 終止 各孔加2mol/L硫酸50μL終止反應。

1.5.8 讀數(shù) 用酶標儀在450nm處測定吸光值A，以陰性對照孔調零，以醇溶蛋白標準溶液A值及相應的濃度對數(shù)作直線回歸，得回歸方程，將待測樣品A值代入回歸方程求出相應的醇溶蛋白含量。

1.6 方法驗證

1.6.1 醇溶蛋白定量標準曲線的建立 將1mg/mL醇溶蛋白母液精確稀釋成4.88、9.77、19.53、39.06、78.13、156.25、312.5、625、1250、2500、5000、10000、20000ng/mL一系列濃度的標準品，以醇溶蛋白標準品的A值為縱坐標，相應的濃度對數(shù)為橫坐標，建立標準曲線，根據(jù)直線回歸方程計算待測樣品中的醇溶蛋白含量。

1.6.2 精密度、準確度和重復性驗證 在檢測范圍內將醇溶蛋白母液精確稀釋成一定濃度，每一濃度重復測定6次，另外在三次實驗中每個濃度重復測定6次。分別取測定結果的平均值，根據(jù)回歸方程計算醇溶蛋白含量的測定值，并計算其標準差（S）、變異系數(shù)（CV%）和回收率（%），評價此方法的精密性、準確性和重復性。

1.6.3 特異性驗證 按照1.2樣品處理方法處理樣品1～16，上清用樣品稀釋液稀釋40倍，檢測A值，與陰性對照比較，以P/N≥2.1為陽性。陽性為有交叉反應，陰性為無交叉反應。

1.6.4 穩(wěn)定性驗證 將本實驗的試劑配制成試劑盒，分別在4℃放置7、10、14d，按照上述ELISA檢測方法測定醇溶蛋白標準品A值，相比較觀察試劑的穩(wěn)定性。

2 結果與分析

2.1 包被抗體和酶標抗體的最適濃度

2.1.1 酶標抗體濃度的初步確定 以10μg/mL醇溶蛋白包被酶標板，將酶標記兔抗醇溶蛋白抗體從1∶100的稀釋濃度開始，按2n倍比稀釋成不同濃度，以ELISA直接法的單因素實驗測定450nm處的A值。取A值為1.0時的稀釋度作為酶標抗體的工作濃度［4］，當稀釋度為6～7時符合條件，所以酶標記抗體的工作濃度約為1∶6400～1∶12800。

2.1.2 包被抗體濃度的初步確定 選擇鼠抗醇溶蛋白單抗的初始濃度為40μg/mL，按2n倍比稀釋成不同濃度包被酶標板，加入工作濃度為1∶5000的HRP標記羊抗鼠IgG，以ELISA直接法測定450nm處的A值?？梢缘贸?，鼠抗醇溶蛋白單抗包被濃度由40μg/mL降至1.25μg/mL時，A值變化不大；降至1.25μg/mL以下時，A值隨之明顯降低。說明抗醇溶蛋白單抗的濃度達到約1.25μg/mL時，酶標板達到最大包被吸附量，此時能夠最大量的捕獲目的蛋白。因此，初步確定包被抗體的工作濃度為1.25μg/mL左右。

2.1.3 包被抗體和酶標抗體的最適濃度 根據(jù)單因素實驗結果，選擇包被抗體濃度為1、2、4μg/mL包被酶標板，酶標抗體濃度為1∶6000、1∶8000、1∶10000、1∶12000，分別設置陽性對照和陰性對照，以方陣滴定法測定結果顯示，包被抗體濃度為2μg/mL，酶標抗體濃度為1∶8000時，陰性對照值為0.08，陽性對照與陰性對照相差最大，為最適的包被抗體和酶標抗體濃度配伍。

表1 9種配方封閉液的封閉效果

表2 ELISA的準確度、精確度、重復性實驗

2.2 封閉液選擇

選擇合適的封閉液，能夠有效減小背景信號的干擾，增強陽性樣品的信號，即減少非特異性反應［5］。在最適的包被抗體濃度和酶標抗體濃度下，選擇9種配方的封閉液，分別做抗體夾心ELISA檢測的A值如表1。顯然，以10%FBS（PBS/T20溶解）做封閉液，陰性值最低，陰陽性差別最大，封閉效果最好。

2.3 標準曲線的線性范圍和檢測限

將4.88～20000ng/mL的醇溶蛋白標準品在所建立的抗體夾心ELISA法中檢測，每個濃度檢測3次，取A值的平均值與對應的濃度對數(shù)進行線性分析，結果顯示最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2= 0.9957，定量檢測限為19.53ng/mL。

圖1 醇溶蛋白檢測標準曲線

2.4 精密度、準確度和重復性驗證

在檢測范圍內將醇溶蛋白母液精確稀釋成1000、500、50ng/mL，每一濃度重復測定6次，另外在三次實驗中每個濃度重復測定6次。分別取測定結果的平均值，根據(jù)回歸方程計算醇溶蛋白含量的測定值，并計算其標準差（S）、變異系數(shù)（CV%）和回收率（%），結果如表2。在同一次實驗內，樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，說明本法準確度比較高。同一次實驗內精密度CV為3.07%～5.91%，3次實驗間精密度CV為0.26%～5.24%，說明本法精密度較高，重復性較好。

2.5 特異性驗證

按照1.2樣品處理方法處理樣品1～16，根據(jù)本實驗的定量檢測限19.53ng/mL，上清用樣品稀釋液稀釋50倍，相當于原始樣品稀釋了500倍，檢測限19.53ng/mL乘以稀釋倍數(shù)后，約為7.81μg/mL，即7.81ppm，屬于無麩質范圍。因此，樣品測定的A值在檢測限以下，即P/N＜2.1，均判定為陰性，以P/N≥2.1為陽性。實驗結果表明：

富凱小麥胚芽，宏光麥仁，宏光小麥為強陽性，宏光大麥表現(xiàn)為陽性。

宏光燕麥米，宏光燕麥片，宏光糙米，宏光玉米面均為弱陽性，帶入回歸方程計算出含量均小于10ppm。

宏光蕎麥米，宏光長粒糯米，宏光圓粒糯米，宏光黑香米，宏光薏仁米，宏光大黃米，宏光西米，宏光高粱米均為陰性。

說明本實驗對小麥醇溶蛋白有較強的特異性，但對大麥有一定的交叉反應。

2.6 穩(wěn)定性驗證

將本實驗的試劑配制成試劑盒，分別在4℃放置7、10、14d后測定，對于500ng/mL和50ng/mL濃度的醇溶蛋白標準品分別測定6次，回收率在92.58%～114.84%之間，回歸方程的R2在0.9817～0.9984之間，CV為3.52%～5.95%之間。并且本實驗用的抗體、醇溶蛋白母液等試劑原液在4℃放置1個月，效價均沒有降低，表明本實驗的穩(wěn)定性較好。

2.7 試劑盒應用

取樣品宏光小麥、宏光大麥、宏光燕麥片、宏光玉米面、君盛爽滑蛋面，按照上述1.2樣品處理方法處理后，用樣品稀釋液稀釋50倍，每份樣品做6次測定，帶回標準曲線，計算各樣品中醇溶蛋白含量，乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實際醇溶蛋白含量（表3）。

表3 實測陽性樣品的實際醇溶蛋白含量

3 結論

應用酶聯(lián)免疫法檢測麥醇溶蛋白，為食品中醇溶蛋白的定量檢測提供了簡便快速的手段。醇溶蛋白作為小麥麩質的主要蛋白質，約占麩質蛋白含量的一半，定量檢測醇溶蛋白的含量，能估算出麩質蛋白的含量，從而根據(jù)無麩食品定義以20ppm為界限，應美國《食物過敏原標簽及消費者保護法》的要求，在食品標簽上標識是否為無麩食品。乳糜瀉患者從此可以根據(jù)標簽標識選擇可以食用的食品。

目前，國內外檢測醇溶蛋白主要采用ELISA方法，而市面上大部分銷售的都是檢測人血清中抗醇溶蛋白抗體的ELISA試劑盒，只能在醫(yī)學診斷層面上檢測患者血清，確定患者是否患乳糜瀉病。而從預防角度上，檢測食品中的醇溶蛋白，只有國外的商品化ELISA試劑盒，但是價格非常昂貴。國內目前尚無標準化和商品化的檢測醇溶蛋白的ELISA試劑盒。因此，需要建立一種有效的定量檢測過敏原醇溶蛋白的方法，為ELISA試劑盒的研制提供理論依據(jù)，彌補國內商品化ELISA試劑盒的空缺。

本文所建立的抗體夾心ELISA法，以2μg/mL的鼠抗醇溶蛋白單抗包被酶標板，1∶8000的HRP標記兔抗醇溶蛋白抗體作為酶標抗體，檢測小麥醇溶蛋白含量的最佳的線性范圍是19.53～5000ng/mL，R2≥0.99，定量檢測限為19.53ng/mL，對應的食品樣品檢測限為7.81ppm。樣品的回收率在93.57%～105.72%之間，實驗內 CV為3.07%～5.91%，實驗間CV為0.26%～5.24%，但對大麥有一定的交叉反應性，可在4℃放置兩周，穩(wěn)定性較好。本實驗的初步驗證表明，本法準確度和精密度高，重復性和穩(wěn)定性好，特異性較強，為進一步研制醇溶蛋白ELISA定量檢測試劑盒奠定了基礎。

［1］毛煒翔，高金燕，陳紅兵.小麥過敏研究進展［J］.食品科學，2007，28（8）：559-562.

［2］Herbert Wieser.Chemistry of gluten proteins［J］.Food Microbiology，2007，24：115-119.

［3］榮建華，許金東，張東星，等.小麥醇溶蛋白提取條件的研究［J］.糧食與飼料工業(yè)，2006（3）：14-15.

［4］金伯泉.細胞和分子免疫學實驗技術［M］.西安：第四軍醫(yī)大學出版社，2002：34-35.

［5］Takai T，Ochiai Y，Ichikawa S，et al.Enzyme-linked immunosorbent assays with high sensitivity for antigen-specific and total murine IgE：a useful tool for the study of allergies in mouse models［J］.Allergol Int，2009，58（2）：225-235.

Quantitative determination of gliadin protein from wheat in foods by ELISA method

QIN Qian-ru1，GAO Hong-wei2，MA Hong-ming1，*
（1.College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.Shandong Technical Center of Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Qingdao 266002，China）

To establish a method for quantitative analysis of gliadin from wheat in foods by ELlSA.The mouse anti-gliadin McAb was used as a coating antibody in the concentration of 2μg/mL，and a horseradish peroxidaseconjugated anti-gliadin as an enzyme-labeled antibody in the optimal working dilution of 1∶8000，and a series of concentrations of gliadin solution as standards.The contents of gliadin in samples were determined.The optimal linear range was 19.53～5000ng/mL and R2≥0.99.The quantitative limit of detection was 19.53ng/mL，which was corresponding to 7.81ppm in food samples.The recovery rate for the accuracy test was 93.57%～105.72%.The coefficient of variation for precision assay were 3.07%～5.91%in the same test and 0.26%～5.24%among three tests.Cross reaction was only observed with barley.The set of kit could be placed 4℃for two weeks.The method is sensitive，accurate，specific.lt is suitable for quantitative determination of gliadin in foods.

gliadin；ELlSA；quantitative determination

TS207.3

A

1002-0306（2010）11-0360-04

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

秦倩茹（1984-），女，在讀碩士，研究方向：食品安全與質量控制。

科技部質檢公益項目（2007GYJ036）。