褚福強，張敬澤，郭得平

（1.浙江大學生物技術研究所，杭州，310029；2.浙江農(nóng)業(yè)大學園藝系）

美味黑穗菌(Ustilago esculenta)是寄生在菰草（Zizania latifolia）上的一種活體營養(yǎng)型真菌。美味黑穗菌侵染菰草后在莖的上部產(chǎn)生膨大結(jié)構(gòu)，稱為茭白，作為水生蔬菜而廣泛種植。真菌侵染寄主后與寄主建立和諧的營養(yǎng)關系，以菌絲體的形式完成它的整個生活史，不像其他黑穗菌引起明顯的癥狀[1～2]。然而，在人工栽培條件下，菰草可能逃避了美味黑穗菌侵染，不形成膨大結(jié)構(gòu)，這些植株在生產(chǎn)上也被稱為雄茭[3]。但迄今還不清楚雄茭形成的機制，早期診斷茭白和雄茭主要依據(jù)種植者經(jīng)驗和植株形態(tài)學細微特征，缺乏準確、迅速區(qū)分它們的有效手段。雖然一些細胞學研究為理解真菌與寄主互作的分子機制研究提供了細胞學基礎，也為早期診斷茭白和雄茭提供了技術手段。但原先的細胞學觀察需要復雜的樣品處理過程（包括樣品固定、系列脫水、包埋和切片等步驟）和相關設備[4，2]，限制了這些技術的廣泛應用。

因此，本文主要報道一種簡單、快速觀察美味黑穗菌菌絲的新方法。利用該方法，不僅能有效觀察真菌在寄主中的菌絲形態(tài)、菌絲分布，也能用于早期快速、準確診斷茭白和雄茭植株，也為研究雄茭形成的機制提供技術手段。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

茭白品種浙茭2號和雄茭植株均來自浙江大學試驗農(nóng)場。

1.2 樣品處理

分別從茭白和雄茭植株的不同部位（茭白、莖、根、芽和葉鞘）取樣，用徒手切片切取組織樣品，每個樣品截面大小為 0.5 cm×0.4 cm，厚 20～30 μm。樣品處理采用修改的Latude-Dada（1996）方法，包括樣品脫色和染色過程。樣品首先在脫色液（0.15%三氯乙酸溶解在3∶1（w/v）的乙醇和氯仿混合液中）中脫色，脫色時間依賴材料幼、老程度。收獲時期的茭白脫色時間為 14～16 h，成熟的根、莖為 18～20 h，幼嫩葉鞘和芽為14 h。樣品脫色后用蒸餾水漂洗3次，隨后進行染色。用0.025%苯胺藍乳酚油染色液對樣品染色，染色時間依據(jù)材料的著色程度而定。收獲時期的茭白、成熟的根和莖染色時間為3～4 h，幼嫩葉鞘和芽為4～5 h。染色后用蒸餾水對染色樣色沖洗3次，然后用20%的甘油作浮載劑制片。如果個別樣品染色過深，可將樣品從載玻片再移入蒸餾水，在水平搖床上震蕩褪色約1～2 h（視著色程度而定），或用70%的酒精代替蒸餾水進行褪色5～10 min（隨后用蒸餾水漂洗3次）。

1.3 細胞學觀察

細胞學觀察和照相在具有Axiocam CCD攝像頭和Axiovision數(shù)字成像軟件（AxioVision Software Release 3.1.,ver.3-2002；Carl Zeiss Vision Imaging Systems）的Zeiss Axiophot 2顯微鏡上進行。以上處理的樣品也可直接用于共聚焦顯微鏡[激光掃描共聚焦顯微鏡Leica TCS-SP 59（具有HCX PL APO CS 63×NA 1.3 glycerol immersion objective）]觀察。

2 結(jié)果與分析

采用修改的Latude-Dada方法處理茭白植株樣品，可清楚觀察到美味黑穗菌在茭白植株不同器官中的菌絲分布。圖1顯示了真菌分布在茭白、莖、葉鞘和芽的維管束組織和薄壁組織中，這些正如原先描述的。但和原先的方法相比較，該方法由于對組織進行了脫色，增加了視野的景深，可觀察到更多層次的信息，使圖像有較強的立體感；而原先方法獲得的圖像僅是一個截面上的信息。所有該方法獲得的圖像，能提供真菌菌絲在寄主組織內(nèi)更豐富的信息，擴大了理解真菌與寄主互作的細胞學特征視野。

真菌主要沿著寄主細胞間擴展，也可侵入寄主細胞中，通常在菌絲頂端產(chǎn)生不規(guī)則的、短而多的分枝，稱為菌絲簇（hyphal clusters）；也可能產(chǎn)生大量的、類似酵母的細胞，形成菌絲聚集體（hyphal aggregations）。在成熟和幼嫩的組織中，真菌都能形成菌絲聚集體或菌絲簇。所以，美味黑穗菌在茭白植株中產(chǎn)生聚集體和菌絲簇是一個普遍特征。相比較，在雄茭植株不同器官上，都沒有真菌菌絲存在。

由于苯胺藍具有發(fā)色團，使切片組織細胞著色后，直接可在共聚焦顯微鏡下觀察。在共聚焦顯微鏡下，圖2清楚顯示茭白芽組織中一個激光掃描縱截面——維管束中的真菌菌絲可沿著細胞間向維管束間組織擴展，并在薄壁束鞘（parenchymoutous bundle sheath）細胞間形成菌絲聚集體。同樣，該方法處理的樣品在共聚焦顯微鏡下不僅可獲得二維圖像數(shù)據(jù)，也可經(jīng)計算機圖像處理三維重建軟件重新組，獲得標本的三維結(jié)構(gòu)，揭示亞細胞結(jié)構(gòu)的空間關系（沒有顯示圖）。

3 小結(jié)與討論

本文采用修改的Latude-Dada（1996）方法。該方法已廣泛用于研究炭疽菌屬種（Colletotrichum species）在侵染寄主過程中的細胞學特征的觀察[5～6]，但這些研究僅限于在寄主葉片上。本文研究表明，該方法用于組織切片，也能取得很好的染色效果。

如何減少雄茭的形成，是生產(chǎn)上亟待解決的問題。但由于雄茭形成機制研究的滯后，這一問題還未從根本上解決。然而，細胞學研究是觀察植物成功地逃脫真菌侵染的最直接的方法，而本研究提供了研究雄茭形成機制的技術手段。

[1]Chung K R,Tzeng D D.Nutritional requirements of the edible gall-producing fungus Ustilago esculenta[J].J Biol Sci,2004,4:246-252.

[2]Chan Y S,Thrower L B.The host-parasite relationship between Zizania caduciflora Turcz and Ustilago esculenta P.Henn.I.Structure and development of the host and hostparasite combination[J].New Phytol,1980,85:201-207.

[3]Xu X W,Ke W D,Yu X P,et al.A preliminary study on population genetic structure and phylog-eography of the wild and cultivated Zizania latifolia (Poaceae)based on Adh1a sequences[J].Theoretical and Applied Genetics,2008,116:835-843.

[4]Yang H C,Leu L S.Formation and histopathology of galls induced by Ustilago esculenta in Zizania latifolia[J].Phytopathology,1978,68:1 572-15 76.

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[6]O'Connell R,Herbert C,Sreenivasaprasad S,et al.A novel Arabidopsis-Colletotrichum pathosystem for the molecular dissection of plant-fungal interactions[J].Molecular Plant-Microbe Interactions,2004,17:272-282.

圖1 美味黑穗菌在浙茭2號品種不同器官中的菌絲分布顯微圖

圖2 共聚焦顯微圖顯示美味黑粉穗菌在浙茭2號品種幼芽中的菌絲分布