梁志懷，魏林，安哲宇

（1.湖南省植物保護(hù)研究所，湖南長沙，410125；2.中南大學(xué)研究生院隆平分院）

蓮藕是近幾年農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)優(yōu)化調(diào)整、生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要水生蔬菜之一，大田種植、池藕開發(fā)已成為農(nóng)民增收的主要經(jīng)濟(jì)來源。蓮藕腐敗病為蓮藕生產(chǎn)上的主要病害，給蓮藕生產(chǎn)造成較大的損失，嚴(yán)重的可使蓮藕商品價(jià)值減少60%以上[1]。由于藕農(nóng)常習(xí)慣于周年和連年的重茬種植，該病的發(fā)生有逐年加重的趨勢(shì)。蓮藕腐敗病的初侵染源是帶菌的種藕和帶病的土壤，最初發(fā)病受害部位為地下莖，不易觀察，常失去最佳防治時(shí)期，化學(xué)防治收效不大。因此，利用抗病品種是防治蓮藕腐敗病最為有效的措施，這就有必要確定腐敗病菌的致病力與優(yōu)勢(shì)種群。本文研究確定了測(cè)定蓮藕腐敗病菌致病性的快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便鑒定的方法，并對(duì)供試菌株間的致病性分化與遺傳背景間差異性的關(guān)系作了初步分析，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

選取蓮藕腐敗病主要致病菌鐮刀菌作為供試菌株，7個(gè)鐮刀菌菌株中有5個(gè)菌株為不同區(qū)域發(fā)病藕上分離、純化培養(yǎng)獲得，另2個(gè)菌株為從百合、黃瓜枯萎病病株上分離、純化培養(yǎng)獲得。7個(gè)供試菌株來源分別為 F1：長沙縣藕田病株；F2：湘鄉(xiāng)藕田病株；F3：超市病藕；F4、F5：長沙市菜市場(chǎng)病藕；F6：百合枯萎病株；F7：黃瓜枯萎病株。

1.2 供試藕塊

從藕田里取長勢(shì)較為一致的健康嫩藕節(jié)，取中間段6 cm，從中間縱切后供試。

1.3 不同接種方法測(cè)定供試病原菌致病性[2，3]

①病原菌菌絲牙簽接種 接種物培養(yǎng)：將供試鐮刀菌移植于PDA培養(yǎng)基平板上，于25℃下恒溫培養(yǎng)4～5 d，備用；選用軟木質(zhì)牙簽，水煮2～3次（防止牙簽上的化學(xué)酚類物質(zhì)等抑制鐮刀菌的生長），每次煮1 h，煮后用清水沖洗2～3次，晾至半干后將牙簽尖部輕放于裝有PDA培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，牙簽的尾部用滅菌的直徑0.5 cm的濾紙托起，每皿放3根，將7個(gè)供試鐮刀菌菌塊（0.5 cm×0.5 cm）分別接種于培養(yǎng)皿的中央，置于25℃下培養(yǎng)，使病原菌從培養(yǎng)基向牙簽上蔓延生長，當(dāng)牙簽從尖部被病原菌覆蓋至牙簽的1/4后，用于供試藕塊的接種。

病原物接種：先用滅菌的大號(hào)注射針頭在藕塊要接種的部位刺1 cm深（防止直接用牙簽插入時(shí)附著在牙簽上的病原菌脫落），再將帶菌牙簽插入藕塊接孔中，每孔接牙簽2根，每藕塊接3個(gè)孔。接種后的藕塊置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。

②病原菌菌絲塊接種 藕塊接種：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的各供試鐮刀菌用7 mm無菌打孔器在無菌的條件下，自菌落邊緣切取菌餅，用接種器將菌餅接種于藕塊的中央，菌絲面朝下，每藕塊接種1個(gè)菌餅，接種后將藕塊置（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。

藕葉接種：配置植物營養(yǎng)液，將初展的嫩葉插入裝有基本植物營養(yǎng)液的燒杯中，將藕塊接種中制備的菌絲塊接種在葉片距邊緣8 cm處，相距10 cm放置1塊，菌絲塊上放置滅菌的棉花團(tuán)保濕，再將藕葉連同燒杯置（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以接種不含菌絲體的等體積瓊脂塊為對(duì)照。

③病原菌孢子懸浮液接種 病原菌孢子懸浮液的制備：將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的各供試菌株的菌絲體，加適量的無菌水清洗，用4層滅菌紗布過濾后，用無菌水將孢子量調(diào)整為1×108個(gè)/mL，制備成供試孢子懸浮液。

藕塊接種：將縱切的藕塊置于保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，每藕塊均勻噴霧15 mL孢子懸浮液，置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。以噴霧蒸餾水為對(duì)照。

藕葉接種：采用與藕塊接種的相同方法處理藕葉，將孢子懸浮液均勻地噴霧于葉片上，接種后的葉片連同燒杯置于（26±1）℃溫度條件下的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以噴霧蒸餾水為對(duì)照。

不同菌株藕塊接種15塊，葉片接種6片。9 d后記錄各處理發(fā)病率；按調(diào)查的病級(jí)數(shù)，計(jì)算病指。

1.4 病害發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)腐敗病在蓮藕葉片、地下莖的發(fā)病特點(diǎn)，確定病害發(fā)病分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。

①接種藕塊病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) 0級(jí)：藕塊生長正常、完好；1級(jí)：藕塊有輕微病變，病變尚未侵入藕塊組織；2級(jí)：藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3級(jí)：藕塊維管束呈深褐色，變色部分占總面積的10%以下；4級(jí)：變色部分占藕塊總面積的10%～30%；5級(jí)：變色部分占藕塊總面積的30%以上。每個(gè)藕塊為一計(jì)量單位。

②接種葉片病級(jí)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn) a.菌絲塊接種葉片。0級(jí)：葉片上未見癥狀；1級(jí)：淺褐色病斑環(huán)在葉片上擴(kuò)展 0～3.0 cm；3 級(jí)：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴(kuò)展 3.0～3.5 cm；5 級(jí)：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴(kuò)展 3.5～4.0 cm；7 級(jí)：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴(kuò)展 4.0～4.5 cm；9 級(jí)：水浸狀病斑環(huán)在葉柄上擴(kuò)展4.5 cm以上。以每個(gè)菌絲塊為一計(jì)量單位。

b.孢子懸浮液噴霧接種葉片。0級(jí)：無病癥；1級(jí)：接種葉出現(xiàn)可見的褪綠小點(diǎn)或黃色小點(diǎn)；2級(jí)：接種葉出現(xiàn)1～5個(gè)黑色斑點(diǎn)；3級(jí)：接種葉上出現(xiàn)10個(gè)黑色斑點(diǎn)或葉尖出現(xiàn)黑斑；4級(jí)：接種葉上出現(xiàn)11～15個(gè)黑色斑點(diǎn)；5級(jí)：接種葉上出現(xiàn)16～20個(gè)黑色斑點(diǎn)；6級(jí)：接種葉上出現(xiàn)20個(gè)以上黑色斑點(diǎn)。整個(gè)葉片十字交叉分為4等份，每1份為1個(gè)計(jì)量單位。

1.5 供試病原菌遺傳差異性分析

①供試病原菌菌絲體的培養(yǎng) 在PDA平板上培養(yǎng)5 d的供試菌株菌落邊緣取10 mm×10 mm的菌絲塊，轉(zhuǎn)入100 mL的PD液體培養(yǎng)基中，25℃條件下?lián)u床120 r/min震蕩培養(yǎng)6 d，真空抽濾獲得菌絲體后，分別用無菌水和滅菌的生理鹽水洗滌2次后，45℃烘干備用。

②DNA的提取 具體操作參照曹宜等方法[4]，略作修改。

③引物篩選和RAPD擴(kuò)增 從18條擴(kuò)增條帶數(shù)量適中、條帶清晰可辨的隨機(jī)引物（均由上海生工生物公司合成）中，進(jìn)一步篩選出主帶明顯、穩(wěn)定的3條隨機(jī)引物作為試驗(yàn)用引物。其引物序列分別為：S6 5'TGCCGAGCTG 3'；S11 5'TGGACCGGTG 3'；S16 5'AGATGCAGCC 3'。

PCR反應(yīng)體系總體積為25 uL。其中：模板DNA 1 μL（50 ng），隨機(jī)引物 1 μL（約 5 pmol），10×PCR Buffer（含 Mg2+） 2.5 μL，dNTP 2 μL，Taq 酶 1 單位（U）0.5 U，加 ddH2O 至 25 μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃ 預(yù)變性4 min； 循環(huán)：94℃變性30 s,37℃退火30 s，72℃ 延伸1 min，共35輪循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后,72℃ 延伸8 min，16℃保溫。

檢驗(yàn)： 取 PCR 產(chǎn)物 7.5 μL 加 2.5 μL 上樣緩沖液于2% 瓊脂糖膠（含0.5 μg/mL溴化乙錠） 上穩(wěn)壓100～110 V電泳1.5 h。紫外檢測(cè)儀觀察、拍照。

④數(shù)據(jù)分析 根據(jù)供試菌株RAPD-PCR擴(kuò)增條帶的有無，以1，0記數(shù)。統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定、清晰的條帶，采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試病原菌不同接種方法對(duì)寄主發(fā)病的影響

試驗(yàn)中采用5種方法對(duì)供試病原菌進(jìn)行人工接種，接種藕塊和葉片發(fā)病情況表明，所有接種方法都可導(dǎo)致接種體發(fā)病，且人工接種植株的感染癥狀與大田中自然發(fā)病的相同，在接種病株的再分離中所得病原菌的形態(tài)和培養(yǎng)性狀與接種菌完全一致。

供試藕塊和葉片發(fā)病情況見表1。如表1所示，所有供試菌株中以菌絲塊對(duì)藕塊接種所致發(fā)病率最高，且發(fā)病最嚴(yán)重，病情指數(shù)最高。用病原菌菌絲體牙簽接種，藕塊的發(fā)病率雖然也較高，但與菌絲塊接種相比，無顯著差異，但接種藕塊的發(fā)病嚴(yán)重度則低于菌絲塊接種。孢子懸浮液噴霧接種，則是葉片接種的較好方法，該方法接種病原菌后，葉片的發(fā)病率及發(fā)病程度均高于藕塊的。試驗(yàn)結(jié)果還表明，不同接種方法，接種物出現(xiàn)癥狀的時(shí)間不同，菌絲塊接種的藕塊4 d左右即出現(xiàn)典型的癥狀，孢子懸浮液噴霧接種的葉片6 d左右才出現(xiàn)典型的癥狀。

表1 供試病原菌不同接種方式的發(fā)病程度

試驗(yàn)結(jié)果表明，用藕塊進(jìn)行腐敗病病原菌致病性測(cè)定時(shí)，可選擇病原菌菌絲塊接種的方法；用藕葉進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可選擇孢子懸浮液噴霧接種的方法。綜合考慮接種物發(fā)病嚴(yán)重度，病情調(diào)查時(shí)記數(shù)的復(fù)雜性和接種后保濕效果好壞等因素，最適宜的方法應(yīng)首選藕塊菌絲塊接種測(cè)定的方法。

2.2 不同來源病原菌對(duì)寄主致病性存在著分化

試驗(yàn)中所采用的5種接種方法測(cè)定蓮藕腐敗病菌的致病力，試驗(yàn)表明，供試的7個(gè)菌株間的致病力均表現(xiàn)出差異性，存在明顯的致病性分化，但這種菌株間致病力差異與菌株地域來源并未表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。并且，各供試菌株在不同接種方法下，其所表現(xiàn)出的致病力強(qiáng)度具有一致性，如F1菌株，其在5種不同接種方法下，均表現(xiàn)出較強(qiáng)的致病力；F6菌株在5種接種方法下，致病力表現(xiàn)得都較弱。從表1中還看出，從發(fā)病的藕塊上分離的鐮刀菌菌株對(duì)藕塊、葉片致病力較強(qiáng)；從百合、黃瓜上分離獲得的鐮刀菌菌株對(duì)供試藕塊、葉片也具有一定的侵染性。

2.3 不同來源病原菌遺傳多樣性

引物S16對(duì)6個(gè)供試鐮刀菌病原菌菌株的RAPD擴(kuò)增圖譜見圖1，根據(jù)擴(kuò)增出的譜帶繪制的聚類樹狀圖?？梢钥闯?，來自同一植株（蓮藕）的鐮刀菌菌株間既有共同的特征性譜帶，又有自己特異性的譜帶，菌株間存在著較大的遺傳多態(tài)性。這種多態(tài)性似乎同地域沒有關(guān)系。如分離自湘鄉(xiāng)藕田病株的病原菌與分離自超市病藕的病原菌遺傳相似性非常高（但超市病藕產(chǎn)地不詳）；與分離自長沙病株上的病原菌則存在較大的遺傳距離。而來自百合和黃瓜兩寄主的鐮刀菌，與來自蓮藕寄主的鐮刀菌菌株多存在較大的遺傳差距。

圖1 引物S16對(duì)供試鐮刀菌的RAPD擴(kuò)增圖譜

3 小結(jié)與討論

筆者初步摸索了蓮藕腐敗病菌（鐮刀菌）致病性測(cè)定的室內(nèi)人工接種方法。結(jié)果表明，病原菌菌絲塊對(duì)嫩藕藕塊接種，可達(dá)到發(fā)病率高、發(fā)病程度高的效果，這為鑒定我國蓮藕主產(chǎn)區(qū)不同致病菌之間的小種差異、蓮藕抗病性品種的篩選提供了簡(jiǎn)便、易行、準(zhǔn)確的抗性鑒定人工接種方法，但這種實(shí)驗(yàn)室內(nèi)病原菌與藕塊單純的一對(duì)一的互作結(jié)果所篩選出的蓮藕對(duì)病原菌的抗性與田間表現(xiàn)是否一致，還需要進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同蓮藕腐敗病鐮刀菌病原菌間致病力表現(xiàn)出了一定差異，對(duì)供試菌株基因組DNA應(yīng)用RAPD技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性分析，結(jié)果表明，各菌株間存在一定的遺傳多態(tài)性，因此確定蓮藕主栽區(qū)腐敗病致病菌是否存在生理小種的分化及其強(qiáng)致病性生理小種的篩選，對(duì)該病害的有效防治及抗病品種的選育，就顯得尤為重要。此外，非蓮藕寄主中分離獲得的鐮刀菌對(duì)蓮藕也具有一定的侵染能力，能引起蓮藕腐敗病，在對(duì)蓮藕腐敗病進(jìn)行防治及耕作時(shí)應(yīng)對(duì)這些因素加以考慮。