徐蟬，張敬澤，劉娜，徐曉峰，黃建中，郭得平

（浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江杭州，310058）

茭白黑粉菌（Ustilago esculentaP.Henn.）屬黑粉菌目、黑粉菌科，廣泛分布于中國、越南、日本等東南亞地區(qū)。在茭白（Zizania latifoliaTurcz.）生長期間，正常茭白植株中均存在茭白黑粉菌菌絲，茭白黑粉菌與茭白植株共生，并在茭白植株體內(nèi)分泌代謝產(chǎn)物刺激茭白花莖基部膨大形成肉質(zhì)莖[1]，從而形成經(jīng)濟產(chǎn)量。目前對茭白黑粉菌及茭白植株分子生物學(xué)方面的研究鮮有報道，而要進一步深入研究其分子生物學(xué)特性并得到良好的試驗結(jié)果，就必須獲得適合于內(nèi)切酶酶切和PCR擴增的高質(zhì)量的DNA[2]。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，基于PCR技術(shù)的分子生物學(xué)方法，如直接測序、RAPD分析和AFLP分析研究親緣關(guān)系遺傳多樣性水平，這些都要求一種安全快捷、成本合理且有效的DNA提取方法[3，4]。但由于不同材料的細胞中所含次生代謝產(chǎn)物的種類和含量不同，所以不同材料的DNA提取方法也不盡相同。如提取成年樹木的基因組DNA時不使用液氮[5]；Danilevich等[6]用鹽緩沖溶液高溫沸煮的方法直接提取用于PCR多態(tài)性擴增的酵母和真菌DNA。

1 材料與方法

1.1 材料準(zhǔn)備

茭白黑粉菌成熟冬孢子于2009年秋采自浙江省湖州市德清縣，于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)純化，得到菌落[18]。從PDA培養(yǎng)基上刮下菌落，用無菌去離子水洗滌3次，每次均經(jīng)5 000 r/min離心后傾去上清液，然后將洗滌后的菌落置于45℃恒溫箱中過夜，菌落干燥后即可用于基因組DNA的提取。

茭白植株取自浙江大學(xué)試驗農(nóng)場，田間選取新鮮幼嫩組織直接帶回實驗室立即用于基因組DNA的提取。

1.2 主要儀器

低溫離心機（SIGMA 3K30）、電泳設(shè)備、水平搖床（ZD-9556）、紫外分光光度計、數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（Fine-do X3）、PCR 儀（Gene Company，ABI 2720）等。

1.3 主要試劑及配制

主要試劑：CTAB、Tris、EDTA 均為 Bio Basic Inc；DNA Marker，RNase A，10×Loading Buffer 均為TaKaRa；10 ×PCR Buffer，MgCl2，dNTP，Taq-DNA polymerase、Tris-平衡酚、Goldview核酸染料均購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；其他藥品均為分析純。

CTAB 提取緩沖液：2%（w/v） CTAB；1.4 mol/L NaCl；2.0 mmol/L EDTA；100 mmol/L Tris·HCl（pH值 8.0），高壓滅菌備用。

1.4 提取茭白黑粉菌基因組DNA

①取干燥后的茭白黑粉菌菌落放入無菌研缽中，倒入液氮迅速研磨至粉末狀。把粉末移入滅菌的 1.5 mL eppendorf管中，加入 600 μL 65℃的CTAB 溶液，置 65℃恒溫水浴保溫 0.5～1 h。

②加入氯仿/異戊醇溶液（氯仿/異戊醇/乙醇比例為 20∶1∶4）600 μL，開蓋，通風(fēng)柜中干燥 1～2 min，蓋蓋，置于搖床上輕輕混合15～20 min，然后4℃，1.2萬r/min離心10 min。收集上清液，并重復(fù)操作一次。此時上清液不能帶有下層液相。

③上清液加入等體積異丙醇（-20℃預(yù)冷），將離心管慢慢上下?lián)u動30 s，置于冰上5 min，使異丙醇與水層充分混合至能見到DNA絮狀物。4℃，1萬r/min離心10 min，棄掉上清液，沿管壁緩慢加入1 mL 95%的乙醇，隨后輕輕棄掉，自然風(fēng)干，但不要讓DNA過于干燥。

其實，每個人的生活都是一個樣子，要么一地蔥皮，要么一堆雞毛蒜皮。如果一個家庭的生活不落到吃飯這種實實在在的行動上，它是不會幸福的。

④加入500 μL TE緩沖液，60℃恒溫箱保溫助溶30 min以使 DNA充分溶解。加入RNase A，靜置于37℃恒溫箱保溫30 min。加入等體積的平衡酚500 μL 和氯仿/異戊醇（24∶1）500 μL，顛倒數(shù)次。4℃，1萬 r/min離心 10 min。

⑤收集上清液，加入3 mol/L的 NaAC（體積為上清液的1/10）和100%的凍乙醇（體積為上清液的2倍），置于-20℃沉淀 30 min，然后 4℃，1萬 r/min離心10 min。70%乙醇洗滌，棄去液體，室溫下盡量揮發(fā)殘留乙醇，但不要使DNA完全干燥。加入50～100 μL TE溶液，使核酸溶解，-20℃冰箱保存待測。

1.5 提取茭白植株基因組DNA

取適量茭白植株新鮮組織，步驟①同上。

②加入氯仿/異戊醇溶液（24∶1）600 μL，顛倒數(shù)次混勻，在水平搖床上輕輕混合10 min，然后4℃，1.2萬r/min離心10 min。收集上清液，加入RNase A置于37℃水浴保溫15～20 min，并緩慢顛倒數(shù)次。

③加入等體積的平衡酚300 μL和氯仿/異戊醇（24∶1）300 μL，顛倒數(shù)次。在水平搖床上輕輕混合 10 min，4℃，1.2 萬 r/min 離心 10 min，收集上清液，加入純氯仿600 μL在水平搖床上輕輕混合10 min，4℃，1.2 萬 r/min 離心 10 min。

④取上清液于1.5 mL離心管中，加入等體積異丙醇（預(yù)冷），輕輕顛倒數(shù)次混勻，-20℃冰箱靜置30～40 min。4℃，1萬 r/min離心 10 min，棄掉溶液，加入95%的乙醇，輕輕棄掉溶液，室溫下盡量揮發(fā)殘留乙醇，但不要讓DNA過于干燥。加入500 μL TE緩沖液，60℃保溫助溶30 min使 DNA溶解。

⑤同 1.4。

1.6 基因組DNA質(zhì)量檢測

①紫外分光光度法檢測 取DNA原液，無菌水稀釋50倍，用紫外分光光度計測其在260 nm、280 nm波長處的吸光度，計算A260/A280值。

②瓊脂糖凝膠電泳檢測 制備1.0%的瓊脂糖凝膠（加Goldview染料），分別取6 μL DNA和2 μL 10×Loading Buffer上樣緩沖液混合，用1×TBE緩沖液于100 V電壓電泳40 min，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測并拍照。

③基因組PCR檢測 在PCR儀上進行DNA的PCR擴增，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成真菌通用引物 ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和 ITS4 （5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。 在 50 μL 總反應(yīng)體系中，含真菌通用引物 ITS1（20 μmol/L）和 ITS4（20 μmol/L）各2 μL，模板 DNA 2 μL，MgCl2（25 mmol/L）4 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.5 μL，Taq-DNA polymerase（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 33 μL。PCR 反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min；94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min 共 35 個循環(huán)；72℃延伸7 min。取6 μL 擴增產(chǎn)物和 2 μL 10×Loading Buffer上樣緩沖液混合，用1×TBE緩沖液于100 V電壓電泳40 min，于1.0%瓊脂糖電泳（加Goldview染料），用凝膠成像系統(tǒng)拍照并進行下一步分析。

2 結(jié)果與分析

一般來說，純DNA樣品紫外消光值A(chǔ)260/A280≈1.8，大于 1.9，表明有 RNA 污染，小于 1.6 時，表明樣品有蛋白質(zhì)、酚類等污染。本試驗所提取DNA紫外吸光值 A260/A280在 1.71～1.83（表1），說明采用改進的CTAB法可提取出較高純度的茭白黑粉菌與茭白植株的基因組DNA。

茭白黑粉菌與茭白植株總DNA提取液電泳結(jié)果如圖1所示，可看出DNA提取效果很好，均為完整的基因組DNA，小分子量DNA條帶污染少，蛋白質(zhì)、糖類污染也很少，并且沒有DNA大量降解的情況。本試驗提取的DNA呈乳白色，表明DNA十分純凈。

表1 DNA提取效果

茭白黑粉菌與茭白植株所提取DNA液PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖2所示?？梢钥闯鲕缀诜劬c正常茭白植株P(guān)CR結(jié)果均有條帶而雄茭則無條帶。ITS1和ITS4為真菌通用引物，故而黑粉菌DNA能用PCR擴增出條帶，而正常茭白植株中含有黑粉菌菌絲，所提取DNA液中含有微量茭白黑粉菌DNA，所以其PCR擴增產(chǎn)物有條帶，但是較黑粉菌擴增產(chǎn)物條帶暗，雄茭中無黑粉菌，所以無條帶。由此擴增效果可以看出，本試驗提取的DNA能滿足后續(xù)分子生物學(xué)方面的研究。

3 結(jié)論與討論

茭白黑粉菌與茭白植株為共生體系，正常茭白植株中存在茭白黑粉菌菌絲，目前學(xué)者們對茭白黑粉菌與茭白植株的研究多集中于生理、栽培等方面，分子生物學(xué)方面的研究涉及較少，而進一步深入研究其分子生物學(xué)特性的基礎(chǔ)和關(guān)鍵是獲得高質(zhì)量的基因組DNA。提取高質(zhì)量的DNA將有利于茭白黑粉菌與茭白植株進行DNA雜交、PCR擴增、AFLP及SSR分析、基因組克隆等領(lǐng)域的研究。

圖1 基因組DNA瓊脂凝膠電泳結(jié)果

圖2 PCR擴增產(chǎn)物瓊脂凝膠電泳結(jié)果

CTAB是一種陽離子去污劑，它能與核酸形成復(fù)合物，這些復(fù)合物在低鹽溶液中會因溶解度的降低而沉淀，而在高鹽溶液中可解離，使DNA和多糖分開。本試驗中，對前人所用CTAB法稍加改進，以適于提取高純度的茭白黑粉菌與茭白植株基因組DNA。前人研究表明，CTAB法提取DNA 65℃時最適宜DNA和多糖大量釋放，并且加醋酸鉀（pH值7.5）和4℃離心對消除多糖很關(guān)鍵[19]。本試驗采用了65℃破碎細胞，4℃離心，并采用醋酸鈉溶液代替醋酸鉀溶液，其效果相同。為了保證提取DNA的質(zhì)量，必須要注意以下事項：盡可能選取新鮮幼嫩的茭白組織；茭白黑粉菌需提前培養(yǎng)好大量菌落，提取前菌絲必須沖洗以減少多糖的影響，否則在沉淀DNA時，或無沉淀出現(xiàn)，或得到的絮狀沉淀難以用TE溶解，且純度很低，無法用于下一步分析；收集CTAB與核酸形成的復(fù)合物時不要離心過度，因為形成的沉淀很難再溶解；在分離制備過程中必須采用溫和的條件，同時還要避免核酸降解酶類對其的降解，為此試驗中所用研缽、離心管等最好提前進行滅菌處理。

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