陸葉 ，李良俊 ，梁國(guó)華 ，陳學(xué)好

（1.揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜研究室，揚(yáng)州，225009；2.揚(yáng)州大學(xué)教育部植物功能基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

蓮藕（Nelumbo nuciferaGaertn）是睡蓮科多年生水生草本植物，在我國(guó)南方普遍種植。蓮藕產(chǎn)品鮮藕、藕粉和蓮籽是公認(rèn)的滋補(bǔ)食品，含豐富的淀粉、蛋白質(zhì)、多種維生素和礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)，是優(yōu)良的特色蔬菜和副食佳品，具有很好的營(yíng)養(yǎng)保健功能，深受消費(fèi)者歡迎[1]。隨著我國(guó)加入WTO，蓮藕加工產(chǎn)品鹽漬藕、水煮藕及藕粉等遠(yuǎn)銷(xiāo)日本、韓國(guó)及歐、美等國(guó)家和地區(qū)，已成為我國(guó)重要的出口創(chuàng)匯蔬菜之一。但不同加工產(chǎn)品對(duì)蓮藕品質(zhì)的要求不一致，影響蓮藕加工品質(zhì)的是以淀粉為主的碳水化合物，其中直鏈淀粉含量對(duì)蓮藕加工、食用品質(zhì)有重要影響，而直鏈淀粉的合成由顆粒結(jié)合淀粉合成酶（Granule-bound starch synthase,簡(jiǎn)稱(chēng)GBSS）基因調(diào)控。

因此，本試驗(yàn)以蓮藕幼嫩葉片為材料提取總RNA，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的其他植物GBSS cDNA序列的同源區(qū)域設(shè)計(jì)5'和3'端特異性RACE引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)擴(kuò)增得到蓮藕GBSS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并對(duì)其序列進(jìn)行分析，以期能全面了解蓮藕中該基因催化和調(diào)控直鏈淀粉的合成功能，為脆質(zhì)類(lèi)型蓮藕新品種的分子輔助選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)品種為生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用的“美人紅”。種藕于2009年4月定植于揚(yáng)州大學(xué)水生蔬菜試驗(yàn)基地，栽培管理同大田。晴朗中午選取生長(zhǎng)健壯植株的幼嫩葉片，液氮速凍后置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

E.coli DH5α 感受態(tài)細(xì)胞、LA Taq 酶、pMD18-T載體、DNA凝膠回收試劑盒、DL2000 DNA Marker、3'-Full RACE Kit、5'-Full RACE Kit、限制性?xún)?nèi)切酶 EcoRⅠ和HindⅢ均購(gòu)自TaKaRa公司。

引物和cDNA序列由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成及測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

①幼葉總RNA的提取 采用改良CTAB法提取幼葉總RNA[2]。

②蓮藕GBSS基因cDNA全長(zhǎng)的克隆 a.3'端序列的克隆。所用試劑均來(lái)自TaKaRa的3′-Full RACE試劑盒。

b.引物設(shè)計(jì)。根據(jù)GenBank中已發(fā)表的馬鈴薯和大豆GBSS基因的cDNA序列，在保守區(qū)段設(shè)計(jì)引物（圖1）。

c.5'端序列的克隆。所用試劑均是來(lái)自TaKaRa的5′-Full RACE試劑盒。

d.引物設(shè)計(jì)。根據(jù)得到的蓮藕GBSS基因cDNA 3'端的序列，用Primer 5軟件設(shè)計(jì)5'端RACE引物（圖2）。

2 結(jié)果與分析

2.1 幼葉總RNA的提取、完整性檢驗(yàn)及RACE反應(yīng)

由圖3可以看出，CTAB法提取的蓮藕幼葉總RNA效果較好，其電泳條帶銳利，表明在提取過(guò)程中無(wú)RNA降解現(xiàn)象，可用于下面實(shí)驗(yàn)。

由圖4可以看出，3'端RACE-PCR后出現(xiàn)的條帶大小在1 000 bp左右，5'端RACE-PCR后出現(xiàn)約1 200 bp的條帶，與預(yù)期條帶基本一致。兩個(gè)目的條帶都非常清晰明亮。

圖1 用于引物設(shè)計(jì)的GBSS cDNA序列同源性分析

圖2 用于5'端RACE引物設(shè)計(jì)的蓮藕GBSS基因的cDNA片段

圖3 蓮藕幼葉的總RNA的凝膠電泳圖

圖4 通過(guò)RACE獲得的蓮藕Wx基因cDNA片段

圖5 BamHⅠ和HindⅢ雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒

圖6 蓮藕GBSS基因cDNA全長(zhǎng)序列

圖7 不同植物GBSS基因氨基酸序列同源性比較

圖8 不同植物GBSS基因氨基酸序列的聚類(lèi)分析

2.2 酶切驗(yàn)證

含有蓮藕 Wx基因cDNA片段的重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后得到的條帶大小與預(yù)期條帶大小接近（圖5）。說(shuō)明目的片段已成功克隆進(jìn)載體pMD 18-T，可進(jìn)行基因測(cè)序。

2.3 測(cè)序結(jié)果分析

①序列分析 拼接RACE技術(shù)擴(kuò)增得到的蓮藕GBSS基因cDNA的3'和5'端序列，獲得一條含poly（A）尾，長(zhǎng)度為 2 265 bp的全長(zhǎng) cDNA序列（圖6），GenBank登錄號(hào)為EU938541。該 cDNA序列包含108 bp的5'非編碼區(qū)和309 bp的3'非編碼區(qū)，其長(zhǎng)為1 848 bp的開(kāi)放閱讀框 (ORF)共編碼615個(gè)氨基酸。

用DNAman軟件對(duì)該核苷酸序列與GenBank中其他植物的該基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與水稻（EU735072）、大豆（EF153101）、馬鈴薯（EU403426）cDNA 序列的同源性分別達(dá) 50.64%、64.23%、59.62%。

②氨基酸序列（GBSS）同源性分析 GBSS基因編碼的氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blastp分析發(fā)現(xiàn)，該序列與金魚(yú)草的同源性最高，達(dá)到77%，與馬鈴薯、甘薯的同源性達(dá)到75%，與豆科植物的同源性在70%～75%，與禾本科植物的同源性在65%～70%（圖7）。

用Clustalx軟件將推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank中的其他植物的GBSS基因的氨基酸序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，蓮藕顆粒結(jié)合淀粉合成酶序列（GBSS）與金魚(yú)草、馬鈴薯、甘薯的顆粒結(jié)合淀粉合成酶最為相似，聚在一起。禾本科植物如水稻、小麥、玉米等單子葉植物單獨(dú)聚成一類(lèi)。豆科植物大豆、豌豆單獨(dú)成一類(lèi)（圖8）。

3 討論

顆粒結(jié)合淀粉合成酶（GBSS）在直鏈淀粉合成上起著非常重要的作用。直鏈淀粉含量（Amylose content，AC）被認(rèn)為是決定稻米、小麥?zhǔn)秤闷焚|(zhì)的最主要因子，而蓮藕加工、食用品質(zhì)與淀粉特性及表觀直鏈淀粉含量有關(guān)。表觀直鏈淀粉含量高，蓮藕品質(zhì)相對(duì)較脆嫩爽口；表觀直鏈淀粉含量低，蓮藕品質(zhì)相對(duì)較糯、口感粉酥[3]。同時(shí)有研究表明，淀粉含量多少以及直鏈淀粉和支鏈淀粉含量比例的關(guān)系與Wx基因有密切的關(guān)系[4]。當(dāng)植物體內(nèi)缺乏GBSS蛋白時(shí),合成淀粉中缺乏直鏈淀粉；利用反義RNA技術(shù)特異地抑制Wx基因的表達(dá)，降低GBSS酶的活性，則導(dǎo)致直鏈淀粉含量下降[5，6]，表明GBSS主要調(diào)控直鏈淀粉的合成。研究蓮藕GBSS基因的結(jié)構(gòu)和功能，有利于我們更進(jìn)一步了解蓮藕淀粉合成機(jī)理，為調(diào)控該基因、改良淀粉品質(zhì)提供理論基礎(chǔ)。

過(guò)去的20 a里，一些單子葉谷物如水稻、玉米、小麥等和一些雙子葉植物如馬鈴薯、大豆等編碼GBSS的基因cDNA全長(zhǎng)序列已經(jīng)得到。本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的不同作物GBSS基因cDNA同源序列設(shè)計(jì)特異引物，利用RT-PCR和RACE技術(shù)得到了蓮藕該基因cDAN全長(zhǎng)序列，通過(guò)軟件分析得知其開(kāi)放閱讀框（ORF）為 109～1 956 bp，編碼 615 個(gè)氨基酸。將氨基酸序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行BLAST比對(duì)，與上述作物的同源性為65%～80%，證明試驗(yàn)得到的序列就是蓮藕GBSS基因的cDNA序列。

不同植物GBSS基因氨基酸序列的聚類(lèi)分析與目前所接受的植物學(xué)分類(lèi)大體一致。禾本科植物如水稻、小麥、玉米等單子葉植物單獨(dú)聚成一類(lèi)；豆科植物大豆、豌豆單獨(dú)成一類(lèi)；蓮藕與金魚(yú)草、馬鈴薯、甘薯聚在一起，說(shuō)明這四種植物顆粒結(jié)合淀粉合成酶結(jié)構(gòu)較為相似。聚類(lèi)結(jié)果可初步反映植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中的一些變化。

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