李彧娜，石貴陽，王 武，*，王正祥，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物資源與生物能源研究中心，江蘇無錫214122）

響應(yīng)面法優(yōu)化RHIZOPUS MICROSPORUS VAR.CHINENSIS產(chǎn)生淀粉酶的條件

李彧娜1，2，石貴陽1，2，王 武1，2，*，王正祥1，2，*

（1.江南大學(xué)生物工程學(xué)院工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇無錫214122；2.江南大學(xué)生物工程學(xué)院生物資源與生物能源研究中心，江蘇無錫214122）

對Rhizopus microsporus var.chinensis固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生淀粉酶的條件進行了優(yōu)化。首先采用單因子實驗確定最適固態(tài)發(fā)酵基質(zhì)為小麥麩皮，最適碳源和氮源分別為可溶性淀粉和硫酸銨，通過控制培養(yǎng)基初始pH為3.0、初始濕度為70%時，使其生淀粉酶產(chǎn)量提高3.5倍。在此基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面中心組合設(shè)計對顯著因素進行優(yōu)化，得出每500mL三角搖瓶中含小麥麩皮13.7g、可溶性淀粉0.063g、硫酸銨0.052g時，生淀粉酶產(chǎn)量達到48.50U/mL，比初始產(chǎn)量提高了8倍。

生淀粉酶，響應(yīng)面優(yōu)化，Rhizopus microsporus var.chinensis

生淀粉酶是能夠直接水解不經(jīng)過蒸煮糊化的生淀粉顆粒的一類酶。目前還沒有一個嚴格的生淀粉酶的界定范圍，一般來說，凡是可以直接作用、水解或糖化未經(jīng)蒸煮的淀粉顆粒的酶都可稱為生淀粉酶［1］。生淀粉酶可以將傳統(tǒng)淀粉制糖工藝中的淀粉糊化、液化、糖化合并為一步進行，從而有效縮減生產(chǎn)成本［2］。目前報道的生淀粉酶作用溫度一般在30～40℃，而在淀粉水解過程中適當(dāng)提高水解溫度既可以防止雜菌污染，又能提高水解速率［3］。本研究室在前期工作中分離到一株能夠產(chǎn)生葡萄糖淀粉酶的Rhizopus microsporus var.chinensis菌株。該菌產(chǎn)生的生淀粉酶具有一定耐熱性能和較寬的作用pH范圍，有一定的工業(yè)應(yīng)用前景。本文先通過單次單因子法，找出了該菌株固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中的三個最主要的影響因素［4］，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法對上述三個因子水平及其交互作用進行優(yōu)化與評價，快速有效地確定了多因子系統(tǒng)的最佳條件［5］，確定了該菌株產(chǎn)生淀粉酶的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配方和發(fā)酵參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

所用菌種 分離自貴州遵義百年磨坊的磨盤下泥土，經(jīng)鑒定并保藏于江南大學(xué)中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心。

UV2100紫外可見分光光度計 美國UNICO公司；1-15高速冷凍離心機 德國 SIGMA公司；HB-100恒溫金屬浴 杭州博日科技有限公司；HYG-A全溫搖床柜 太倉市實驗設(shè)備廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 酶活力測定 底物為玉米淀粉顆粒懸浮液，用pH5.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制。在5mL離心管中分別加入1mL底物、0.1mL酶液，在50℃恒溫振蕩（150r/min）反應(yīng)1h后，加入2mol/L NaOH溶液0.05mL終止反應(yīng)，將反應(yīng)液5000r/min離心5min，取上清液測定還原糖的含量。酶活力定義為：在以上分析條件下1min釋放1μmol還原糖所需酶量為一個酶活力單位（U）。

1.2.2 實驗設(shè)計

1.2.2.1 單次單因子法設(shè)計［4］影響發(fā)酵培養(yǎng)的因素很多，本實驗主要考察固體基質(zhì)（稻殼、玉米粉、小麥麩皮、小麥粉和大麥粉），初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度（50%～100%），初始培養(yǎng)基pH（3.0～8.0），用0.1mol/L的HCl或NaOH調(diào)節(jié)；氮源（無機氮源：硫酸銨、氯化銨、硝酸銨，有機氮源：豆餅粉、尿素、蛋白胨），碳源及產(chǎn)酶誘導(dǎo)物（玉米淀粉、土豆淀粉、可溶性淀粉）對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響，采用單因素水平對照實驗選出最佳固體基質(zhì)、初始培養(yǎng)基pH、濕度、氮源和碳源，作為響應(yīng)面法研究的基礎(chǔ)條件。

1.2.2.2 響應(yīng)面法設(shè)計［5］根據(jù)單次單因子法實驗所確定的影響水平，按照中心復(fù)合設(shè)計原理設(shè)計，并利用SAS 8.0軟件包安排實驗。設(shè)計三因素、三水平的實驗，因素水平如表1所示。

表1 發(fā)酵培養(yǎng)基因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 利用單次因子法確定發(fā)酵主要參數(shù)

2.1.1 發(fā)酵基質(zhì)的影響 對于絲狀真菌而言，固態(tài)發(fā)酵方式往往比液態(tài)發(fā)酵方式更不易染菌，酶產(chǎn)量更高。在固態(tài)發(fā)酵過程中，發(fā)酵基質(zhì)的選擇是一個關(guān)鍵的因素。本研究中選擇了五種固體基質(zhì)，依次為：稻殼、玉米粉、小麥麩皮、小麥粉和大麥粉，實驗結(jié)果見圖1。五種基質(zhì)都能夠作為發(fā)酵產(chǎn)酶的良好基質(zhì)，其中小麥麩皮以12.0±0.81U/mL的產(chǎn)酶效果為最佳。小麥粉（10.2±0.79U/mL）和玉米粉（7.5± 0.71U/mL）也是較好的基質(zhì)，但產(chǎn)酶量略低于小麥麩皮。稻殼（6.0±0.72U/mL）和大麥粉（6.8±0.73U/mL）的產(chǎn)酶效果較差。

圖1 培養(yǎng)基中添加不同發(fā)酵基質(zhì)對產(chǎn)酶的影響

2.1.2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度的影響 初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度分別選擇50%～100%，對于固態(tài)發(fā)酵而言，增加或是減少發(fā)酵培養(yǎng)基的濕度都會顯著影響產(chǎn)酶［6］。較高的濕度會導(dǎo)致供氧困難，從而影響氣生菌絲的形成，而較低的濕度會降低營養(yǎng)物質(zhì)在培養(yǎng)基中的溶解度，從而減少營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。實驗發(fā)現(xiàn)當(dāng)初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度為 70%時，產(chǎn)酶量最高為14.1±1.1U/mL（圖2）。

圖2 初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度對產(chǎn)酶的影響

2.1.3 初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH的影響 由于固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基有更好的緩沖能力，絲狀真菌在固態(tài)發(fā)酵時能夠在較寬的 pH范圍內(nèi)生長［7］。本文中菌株Rhizopus microsporus var.chinensis在pH3.0～8.0之間時均能產(chǎn)酶，當(dāng)pH為3.0時，產(chǎn)酶量最高（圖3）。

圖3 培養(yǎng)基初始pH對產(chǎn)酶的影響

2.1.4 不同氮源對產(chǎn)酶的影響 考察了幾種不同的無機和有機氮源對發(fā)酵產(chǎn)酶的影響。其中各種有機氮源（包括豆餅粉、尿素和蛋白胨）對產(chǎn)酶的影響不大，產(chǎn)酶量均在16U/mL左右；而無機氮源中的硫酸銨、氯化銨和硝酸銨均能有效促進產(chǎn)酶，在添加0.2%硫酸銨的情況下，產(chǎn)酶量可達18.2±1.3U/mL。這與Ray等［8］報道的在培養(yǎng)基中添加無機銨鹽能顯著增加Rhizopus oryzae酶產(chǎn)量的結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，持續(xù)增加氮源的量并不能使酶產(chǎn)量進一步增高（圖4）。

圖4 培養(yǎng)基中添加不同氮源對產(chǎn)酶的影響

2.1.5 不同碳源對產(chǎn)酶的影響 淀粉不僅可作為菌株生產(chǎn)的碳源，還可作為產(chǎn)生淀粉酶的誘導(dǎo)物，因此，本文選擇了三種淀粉作為考察對象。作為改性淀粉的一種，可溶性淀粉（20.1±1.2U/mL）比玉米淀粉（18.3±1.1U/mL）和土豆淀粉（18.0±1.2U/mL）更易于被菌株降解和利用，為最佳碳源和誘導(dǎo)物（圖5）。

［1］諸葛斌，姚惠源，姚衛(wèi)蓉.生淀粉糖化酶的結(jié)構(gòu)和作用機理［J］.工業(yè)微生物，2001，31（4）：49-51.

［2］董永存，劉洋，陳源源，等.嗜熱菌來源的生淀粉酶分離純化及其酶學(xué)性質(zhì)［J］.微生物學(xué)報，2008，48（2）：169-175.

［3］van der Maarel MJEC，van der Veen B，Uitdehaag JCM，et al.Properties and applications of starch-converting enzymes of the α-amylase family［J］.Journal of Biotechnology，2002，94：137-155.

［4］楊德.實驗設(shè)計與分析［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：112-120.

［5］張潤楚，鄧海濤，蘭燕，等譯.實驗設(shè)計與分析及參數(shù)優(yōu)化［M］.北京，中國統(tǒng)計出版社，2003：346-350.

［6］Hesseltine CW.Solid state fermentations［J］.Biotechnology and Bioengineering，1972（14）：517-532.

［7］Annunziato ME，Mahoney RR，Mudgett RE.Production of α-galactosidase from Aspergilus oryzae grown in solid state culture［J］.Journal of Food Science，2006（51）：1370-1371.

［8］Ray RC.Extracellular amylase（s）production by fungi Botryodiplodia theobromae and Rhizopus oryzae grown on cassava starch residue［J］.Journal of Environmental Biology，2004（25）：489-495.

圖5 培養(yǎng)基中添加不同碳源對產(chǎn)酶的影響

經(jīng)過單次因子實驗優(yōu)化，確定小麥麩皮為固體基質(zhì)，添加0.2%硫酸銨和0.02%可溶性淀粉并調(diào)節(jié)初始發(fā)酵培養(yǎng)基pH至5.0，初始發(fā)酵培養(yǎng)基濕度為70%時，產(chǎn)酶量達21.2U/mL，比優(yōu)化前提高了3.5倍。

2.2 利用響應(yīng)面法設(shè)計確定培養(yǎng)基組成

通過單次因子實驗確定了三個主要的影響因素后，采用響應(yīng)面分析法來分析三個因素間的相互關(guān)系。表2列出了實驗設(shè)計的組合和實驗結(jié)果。

表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果

擬合線性回歸方程為：R1=47.04-0.84A-1.84B -3.41C+2.10AB-2.52AC+1.16BC-10.34A2-2.89B2-8.77C2

R1為酶活力，該模型高度顯著（p＜0.0001），相關(guān)系數(shù)R2=0.97，能對實驗數(shù)據(jù)進行較好的擬合。

由表3可知，變量的因子分析表明可溶性淀粉和硫酸銨的含量均為影響產(chǎn)酶水平的重要因素。上述兩個變量對產(chǎn)酶水平的影響見圖6。

表3 方差分析

本文選用兩步法優(yōu)化了固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵過程參數(shù)，提高了 Rhizopus microsporus var. chinensis CICIM F0088的生淀粉酶產(chǎn)量。通過單次因子實驗發(fā)現(xiàn)，在單次因子選擇實驗中，小麥麩皮、可溶性淀粉和硫酸銨是影響發(fā)酵產(chǎn)酶的主要因素；基于上述結(jié)果，針對這三個因素做了三水平的響應(yīng)面分析實驗，實驗結(jié)果表明，當(dāng)培養(yǎng)基組成為小麥麩皮13.7g，可溶性淀粉0.063g，硫酸銨0.052g時，產(chǎn)酶的最大值應(yīng)為47.90U/mL，實際實驗中，在發(fā)酵60h后，三次平行實驗的結(jié)果分別為48.50、47.75、48.12U/mL，其產(chǎn)酶水平較優(yōu)化前提高了8倍，與預(yù)測值相符，證實了響應(yīng)面分析方法在本文中的可靠性與統(tǒng)計學(xué)方法的有效性。

圖6 可溶性淀粉（B）和硫酸銨（C）對產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

本課題組在前期研究中篩選得到一株有生淀粉水解能力的絲狀真菌 Rhizopus microsporus var. chinensis CICIM F0088。該菌株所產(chǎn)生的淀粉酶兼具生淀粉水解能力、較高的耐熱性和較寬的pH適用范圍，因而有著廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。但該菌株是從自然界篩選獲得的野生菌株，其產(chǎn)酶水平較低，本文通過單因子篩選和響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)合的方法對其培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，將其生淀粉酶產(chǎn)量提高8倍，為以后工業(yè)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

Optimization of raw starch digesting amylase fermentation condition with Rhizopus microsporus var.chinensis by response surface methodology

LI Yu-na1，2，SHI Gui-yang1，2，WANG Wu1，2，*，WANG Zheng-xiang1，2，*
（1.School of Biotechnology and Key Laboratory of Industrial Biotechnology，Ministry of Education，Jiangnan University，Wuxi 214122，China；（2.Research Center of Bio-resource and Bio-energy，School of Biotechnology，Jiangnan University，Wuxi 214122，China）

The fermentation condition of raw starch digesting amylase by Rhizopus microsporus var.chinensis was optimized.Using single factorial experiments，sources of solid state substrate，carbon and nitrogen were determined as wheat，soluble starch and ammonium sulfate，respectively.Then raw starch digesting amylase production was increased by 3.5 times in the above medium with initial pH of 3.0 and humidity of 70%.The optimal medium composition for raw starch digesting amylase production was determined by response surface methodology as：13.7g wheat，0.063g soluble starch and 0.052g ammonium sulfate in 500mL flask.The enzyme production was increased to 48.50U/mL，which was 7 times higher than that of the original medium.

raw starch digesting amylase；response surface methodology；Rhizopus microsporus var.chinensis

TS201.2+5

A

1002-0306（2010）11-0184-03

2009-11-18 *通訊聯(lián)系人

李彧娜（1981-），女，博士研究生，研究方向：工業(yè)微生物學(xué)和發(fā)酵工程。

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃“863”項目（2006AA020204）。