李國云，王玉明，陳士國，尹利昂，薛 勇，李 琳，薛長湖

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

柱前衍生高效液相色譜法測定鮑魚中糖原含量

李國云，王玉明，陳士國，尹利昂，薛 勇，李 琳，薛長湖*

（中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003）

建立了雙水解-柱前衍生高效液相色譜法測定鮑魚中糖原含量的方法。以木瓜蛋白酶水解鮑魚樣品，釋放出的糖原于2mol/L的三氟乙酸中，110℃條件下水解4h，徹底水解為葡萄糖，利用PMP柱前衍生高效液相色譜法對葡萄糖進行定量。該方法在葡萄糖含量為0.05～1.0mmol/L范圍內(nèi)線性關系良好（R2=0.9994），RSD為2.35%，平均回收率為96.53%，檢測限為0.036mmol/L，定量限為0.06mmol/L。

高效液相色譜，糖原測定，葡萄糖，鮑魚

糖原（C6H10O5）n又稱動物淀粉，作為主要能量貯藏形式［1］，鮑魚中糖原含量較高，并具有調(diào)和浸出物成分的風味，增加濃厚感，使之產(chǎn)生特有風味的作用［2］，鮑魚的風味品質(zhì)與糖原含量呈正相關；當受到外界刺激時，鮮活鮑魚的糖原極易水解，因而糖原含量可作為評價鮑魚鮮度的指標。鮑魚中糖原的定量測定對于鮑魚風味品質(zhì)質(zhì)量評價體系的建立具有重要意義。目前關于鮑魚中糖原的高效液相色譜測定方法尚未見報道。文獻報道，1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）可修飾糖環(huán)的還原端，使其具有高度紫外吸收，修飾糖能在反相高效液相色譜柱上能得到很好的分離，并且衍生過程簡便快捷，用于單糖測定非常有效［3-8］。以高效液相色譜為基礎的多糖的定量方法具有靈敏度高，準確性好的特點。因此，本文利用PMP作為柱前衍生劑，使用高效液相色譜法，研究了鮑魚中糖原含量的測定方法，并對該方法的準確度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性進行了驗證，結(jié)果表明，PMP-柱前衍生高效液相色譜法具有準確度高、重復性及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，可作為水生動物體內(nèi)糖原含量準確測定的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

D-（+）-氨基葡萄糖標準 Fluka公司；L-鼠李糖、D-木糖、D-葡萄糖醛酸、D-（+）-半乳糖醛酸、D-（+）-氨基半乳糖鹽酸鹽、L-巖藻糖標準 Sigma公司；乙腈、甲醇 色譜純，Muskegon公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

Agilent 1100高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器（DAD） 美國安捷倫公司；超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司。

1.2 樣品預處理［9-10］

稱量鮑魚鮮品2g或干樣0.4g經(jīng)水泡發(fā)，剪碎，加入少量水，高速充分勻漿。勻漿液全部加入到30mL的 0.1mol/L乙酸鈉緩沖溶液（pH6.0，內(nèi)含5mmol/L EDTA溶液和5mmol/L半胱氨酸溶液）中，并加入5%（w/w）木瓜蛋白酶，于60℃水浴下恒溫振蕩反應12h之后，酶解液定容至100mL。取0.5mL定容后的酶解液于安倍瓶中，加入0.5mL 4mol/L TFA，充氮封管，于110℃下水解4h后，50℃下氮氣吹干，以水超聲溶解，0.3mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH至中性后定容至 5mL。取 200μL加入 200μL 0.5mol/L PMP、200μL 0.3mol/L NaOH，70℃水浴反應30min，取出冷卻，用200μL 0.3mol/L HCl中和，加入1mL氯仿萃取，充分振蕩，小心吸棄下層，重復3次后，將上層水相過0.45μm微孔濾膜，待高效液相色譜測定。

表1 重復性和精密度實驗結(jié)果（n=6）

1.3 色譜條件［5-6］

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18分離柱（4.6× 250mm i.d，5μm），柱溫：25℃。流動相 A：10%（V/V）乙腈 +0.1mol/L乙酸銨（pH 5.5），流動相B：25%（V/V）乙腈+0.1mol/L乙酸銨（pH 5.5）。采用梯度洗脫：0～40min，45%B～100%B，流速：1.0mL/min。進樣量10μL，檢測波長：245nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品預處理條件選擇與優(yōu)化

目前，鮑魚體內(nèi)糖原測定過程多采用醇沉的提取方法，造成糖原損失嚴重，測量誤差較大。本文采用木瓜蛋白酶將鮑魚水解，釋放糖原，再利用酸水解將糖原徹底水解為葡萄糖，避免了糖原的損失。本文研究了不同濃度的三氟乙酸及不同水解時間對鮑魚中糖原水解條件的影響，確定了最佳的酸水解條件：2mol/L TFA，110℃，4h，如圖1所示。

圖1 不同濃度的TFA、不同水解時間對鮮活鮑魚糖原中糖原含量測定結(jié)果

2.2 色譜條件選擇

參照Fu和O’Neill［5］文獻中所述的色譜條件，實現(xiàn)了葡萄糖和其他9種單糖的有效分離，為了分析測定方便，通過條件摸索，縮短了分析時間，標準品和樣品色譜圖分別見圖2、圖3。

2.3 線性范圍和檢測限考察

準確稱量葡萄糖標準品，配制成0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L系列濃度的標準溶液，采用上述方法衍生測定，每個濃度重復測定三次，以平均值計算。以葡萄糖標準品峰面積（y）對其相應濃度（x）進行線性回歸計算，得標準曲線y=2570.4x-9.0243（R2=0.9994）。

在上述條件下，以儀器的信噪比（S/N）為3條件下相對應的濃度定為檢出限，以S/N為10條件下相對應的濃度為定量限，結(jié)果得到葡萄糖的檢測限為0.036mmol/L，定量限為0.06mmol/L。

圖3 鮑魚水解物高效液相色譜分離圖

圖4 葡萄糖標準曲線

2.4 重復性和精密度

六組皺紋盤鮑平行樣，測定糖原含量的RSD為2.35%，表明該方法對葡萄糖衍生物的檢測重復性良好；吸取0.6mmol/L葡萄糖標準溶液衍生物，連續(xù)進樣6次，得到葡萄糖的RSD=0.23%，表明儀器精密度良好，方法精密度符合要求，結(jié)果見表1。

2.5 回收率實驗

分別向鮑魚樣品酶解液中添加低濃度（0.2mmol/L）、中濃度（0.5mmol/L）和高濃度（0.8mmol/L）三個水平的葡萄糖標準液，按測定方法要求進行回收實驗，水平樣品平行測定6份，結(jié)果見表2?；厥章史謩e為94.11%、97.13%、98.34%，平均加標回收率為96.53%；平行測定的RSD（n=6）分別為3.49%、2.99%、2.72%。均為在置信區(qū)間為95%的回收率，在可接受的范圍之內(nèi)。

表2 鮑魚樣品中葡萄糖的加標回收率

3 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜法測定鮑魚中糖原含量的方法，與其他方法相比［11-16］，具有很多優(yōu)勢。目前傳統(tǒng)的糖原測定方法主要有蒽酮比色法［12］、碘鹽顯色法［13］、酶解分析法［14］等，這些方法主要是對動物組織浸提，二次醇沉等步驟后進行測定。首先二次醇沉法對鮑魚中糖原提取不完全，而測定時采用比色法，易受樣品中的雜質(zhì)如鹽、微量元素、蛋白質(zhì)、色素等的干擾，對目標測定物的選擇性不強，引起較大的測定誤差。本方法采取的木瓜蛋白酶酶解聯(lián)合酸水解可使鮑魚中糖原充分水解為葡萄糖，排除了糖原提取率的影響，測定結(jié)果更為準確。2001年張淑珍等［15］建立了共振瑞利散射法測定糖原含量，但是該方法僅適用于合成樣品及注射樣品中糖原的測定，不適合復雜的鮑魚樣品的測定，而本文建立的方法實現(xiàn)了對酸性、堿性和中性單糖的同步分離，可對葡萄糖進行準確的定量計算，專屬性好，分析時間較Fu等報道［5］的明顯縮短。2008年高瑞昌等［16］建立了一種離子色譜測定牡蠣中糖原的方法，但是該方法中使用的葡萄糖淀粉酶較昂貴，比較而言，本文中糖原的水解采用酸水解，降低測試費用。

綜上所述，本文建立的糖原測定方法具有快速、準確、專屬性好、靈敏度高等特點，可應用于多種鮑魚制品及其他水生動物體內(nèi)糖原含量的測定，并為鮑魚質(zhì)量標準的建立以及鮑魚風味物質(zhì)研究提供了基礎方法。

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Pre-column derivatization—HPLC for the determination of glycogen in abalone

LI Guo-yun，WANG Yu-ming，CHEN Shi-guo，YIN li-ang，XUE Yong，LI Lin，XUE Chang-hu*
（College of Food Science and Engineering，Ocean University of China，Qingdao 266003，China）

The method of double hydrolysis PMP derivatization HPLC determining the glycogen content of abalone was established.Abalone samples were hydrolyzed by papain，to release glycogen，then the hydrolysate was further hydrolyzed for 4h by 2mol/L of trifluoroacetic acid at 110℃，to completely hydrolyze glycogen to glucose. The content of glucose was determined by utilizing PMP pre-column derivatization high-performance liquid chromatography.The linear relationship is good in range of 0.05～1.0mmol/L of the glucose conten（tR2=0.9994）. RSD was 2.35%，average recovery was 96.53%，the limit of detection was 0.036mmol/L，and the limit of quantification was 0.06mmol/L.

HPLC；glycogen determination；glucose；abalone

TS254.7

A

1002-0306（2010）12-0341-03

2009-12-16 *通訊聯(lián)系人

李國云（1987-），女，碩士研究生，主要從事海洋生物多糖研究。

國家科技支撐計劃（2008BAD94B05）。