沈 慶 黃 靜 文秀芳 黃 方 劉 霄 李 華

α1，3 FUCT Ⅶ是一種糖鏈加工酶，能催化巖藻糖基轉移到糖蛋白糖鏈底物，它是產(chǎn)生Slex（又稱為唾液酸化的路易斯X）的重要物質，大量文獻報道Slex在大腸癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤組織中呈明顯增強表達[1-3]，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲轉移和預后密切相關。但α1，3 FUCT Ⅶ其與腫瘤轉移的關系尚不十分清楚。本研究應用RT-PCR法及免疫組織化學催化放大（CSA）檢測α1，3 FUCTⅦ基因mRNA及Slex在非小細胞肺癌組織、癌旁正常肺組織中的表達，探討α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA及Slex的表達與臨床病理因素的關系，以及其在肺癌發(fā)展過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 標本

收集重慶市第三人民醫(yī)院及協(xié)作單位2008年6月至2009年6月期間手術切除肺癌新鮮標本66例（男38例，女28例），平均年齡（51±16）歲。其中腺癌36例，鱗癌30例。癌旁正常肺組織選擇遠離癌組織（＞5cm）的正常支氣管黏膜和肺組織20例作為對照觀察。所有標本均分為2份，另一份投入液氮速凍之后，3h內轉移至-80℃低溫冰箱凍存；一份經(jīng)10%福爾馬林固定，石蠟包埋、切片。

1.2 試劑

Rever Tre Ace-a-逆轉錄試劑盒購自TOYOBO公司，PCR System 9700購自Applied Biosy Stems，PCR Mix Taq購自天跟公司。鼠抗Slex單克隆抗體購自美國Millipore公司，SP試劑盒及0.3% Triton X100均購自北京中杉生物技術有限公司。

1.3 逆轉錄-聚合酶鏈式反應（RT-PCR法）

取標本20～100mg，以TRNzol試劑提取總RNA。將2μg RNA置于10μL逆轉錄反應體系中逆轉錄為cDNA，再行PCR擴增。根據(jù)已知α1，3 FUCT Ⅶ基因序列，由上海生物技術有限公司合成引物，上游：5'-CCC CGC AGC CAA GTC TAT GA -3'，下游：5'-CCA CCC CTG CTT CCT GAC CT -3'（181bp）。GAPDH（內參照）引物上游：5'-TG GGG TGA TGC TGG TGC TGA GT- 3'，下游：5'-AG GTT TCT CCA GGC GGC ATG TC -3'（500bp）。PCR反應條件：94℃預變性10min；94℃變性45s，63℃退火1min，72℃延伸1min。35個循環(huán)；72℃終延伸10min，擴增產(chǎn)物10g/LTBE瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠顯影，凝膠成像系統(tǒng)（UVITec公司）成像。Image-Pro Plus 6.0軟件行半定量分析。目的基因的相對表達量以目的條帶積分光密度（IOD）值與內參照條帶IOD值的比值表示。

1.4 免疫組織化學染色法

采用催化放大法（Catalyzed signal ampli fi cation，CSA）。①標本組織常規(guī)石蠟包埋切片，切片脫蠟、水化；②放入 0.3%的過氧化氫（H2O2）溶液阻斷內源性過氧化物酶，室溫30min； ③0.3% Triton X100室溫30min，以增加細胞的通透性；④滴加小鼠抗人Slex單克隆抗體溶液（一抗），4℃過夜；滴加生物素標記的IgG抗體（二抗）室溫孵育2h；⑤0.05%二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色8～12min。蘇木素襯染，藍化。常規(guī)封片。以非特異性小鼠IgG代替一抗作為陰性對照。結果判斷：Slex陽性信號為細胞胞膜和（或）細胞胞質內出現(xiàn)棕黃色或棕褐色染色顆粒。根據(jù)免疫組織化學染色的每例切片中顯色有無及顯色癌細胞的比例判定陽性或陰性結果：凡無陽性染色細胞或陽性染色細胞數(shù)＜5%者為陰性（-），陽性染色細胞≥5% 者為陽性（+）。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件，α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA表達所得數(shù)據(jù)以±s表示，兩組均數(shù)的比較采用t檢驗，兩組以上均數(shù)的比較采用單因素方差分析。對Slex表達的數(shù)據(jù)進行χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA在非小細胞肺癌組織中的表達

α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA在腺癌組織表達最強（0.79±0.19），在鱗癌組織中表達（0.51±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（P*＜0.05）。在癌旁正常肺組織表達量為（0.45±0.11），與腺癌比較差異有統(tǒng)計學意義（P*＜0.05），與鱗癌比較差異無顯著性（P#＞0.05）。此外，α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA表達與年齡無關（P＞0.05），與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、組織學類型及性別有關（P＜0.05），見表1和圖1。

圖1 α1，3 FUCT ⅦmRNA在癌旁正常組織及非小細胞肺癌組織中的表達

表1 α1，3 FUCT ⅦmRNA的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系

2.2 Slex的表達

66例肺癌組織中有50例Slex的表達陽性，陽性率為75.7%。癌旁正常肺組織20例Slex的表達均為陰性，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。Slex的表達在腺癌陽性率為86%（31/36），鱗癌為63.3%（19/30），差異有統(tǒng)計學意義（P*＜0.05），見圖2。Slex的表達與年齡無關（P＞0.05），與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、組織學類型及性別有關。Slex的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系見表2。

圖2 Slex在非小細胞肺癌中的表達（×100）

表2 Slex的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系

3 討 論

FUCT是一類負責將GDP巖藻糖中的巖藻糖基（Fucose）轉移至糖鏈上N乙酰氨基乳糖單鏈（GlcNAc）上并以α巖藻糖苷鍵相連接的酶。其主要作用底物是糖蛋白的O糖或乳糖系、新乳糖系的糖脂，也可以是N糖鏈，產(chǎn)物主要是含有α巖藻糖基的血型抗原，如ABO血型抗原和Lewis糖鏈抗原（Le）。FUCT Ⅶ是巖藻糖基轉移酶（fucosyltransferase，F(xiàn)UCT）的一個亞型，它是Ⅱ類跨膜拓撲結構，N端有14個氨基酸位于細胞質，接著為19個氨基酸的疏水跨膜區(qū)以及位于高爾基體內的309個氨基酸催化結構域。1994年Sasaki等[4]在THP-C細胞cDNA文庫中克隆出來的。其cDNA全長為1.7kb，開放閱讀框架編碼342個氨基酸，相對分子質量為39.2×103，基因定位在染色體9q34.3。目前的研究發(fā)現(xiàn)，巖藻糖基化參與多種生物學過程，包括組織生長、血管生成、細胞增殖、黏附、侵襲和腫瘤轉移。至少有18種人基因疾病起因于N-糖基化蛋白改變[5-7]。Proro Hamon等[8]的研究顯示，高親和力的選擇素和其配體的相互作用需要core2基礎的0聚糖，它的合成需要巖藻糖轉移酶Ⅶ（FUCT Ⅶ）和磺基轉移酶，以core1前提為底物進行修飾，最終形成側鏈為Slex的core2基礎的0聚糖。而FUCT Ⅶ及其產(chǎn)物Slex對肝癌細胞H7721的轉移能力起至關重要的作用[9]。

Slex（又稱為唾液酸化的路易斯X，Sialyl Lewis-X）是表達在胚胎組織及腫瘤細胞表面糖脂及糖蛋白上的含有寡聚糖的一組碳水化合物抗原，為細胞黏附分子P選擇素所識別的配基。其與P選擇素特異性結合以幫助癌細胞穿過內皮細胞基底膜，與惡性腫瘤的惡化和轉移呈正相關。早在1999年，陳繼華等[10]研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中除了Slex抗原以外，可能還存在有Lex及SDlex。其中，SDlex與惡性腫瘤轉移的關系要比Slex及Lex更密切。目前Hakomori[11]研究提出癌細胞表達糖鏈的兩種機制為：①正常細胞本來就必須表達的糖鏈，在癌細胞則出現(xiàn)糖鏈表達機制的障礙，稱為“糖鏈不全”。②新糖鏈的合成，指的是牽涉糖類決定子合成的腫瘤相關基因。如通過實驗表明唾液酸6-硫代Lex是Slex的N-乙酰葡萄糖胺（GlcNac）基的第6位上有硫酸基結合結構，在正常的大腸黏膜上表達較多，但是隨著惡性程度的逐漸增加，該N-乙酰葡萄糖胺（GlcNac）基的第6位硫酸基修飾能力下降，唾液酸6-硫代Lex的表達逐漸消失，Slex增加。

我們的研究發(fā)現(xiàn)，α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA在腺癌組織表達最強（0.79±0.19），在鱗癌組織中表達（0.51±0.12），差異有統(tǒng)計學意義（P*＜0.05），見表1。Slex的表達在腺癌陽性率為86%（31/36），鱗癌為63.3%（19/30），差異有統(tǒng)計學意義（P*＜0.05），見表2。而且α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA及Slex表達與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、組織學類型及性別有關，與年齡無關。表明α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA及Slex表達可能與非小細胞肺癌的發(fā)生及轉移相關，其檢測可作為判斷患者肺癌轉移一項重要參考指標。而Slex可能是在非小細胞肺癌中表達的主要的Lewis抗原，其在非小細胞肺癌中的高表達與腫瘤的侵襲轉移能力有關。

眾所周知，α巖藻糖轉移酶大家族目前已發(fā)現(xiàn)有9種亞型，其中FUCT-III（Lewis血型，Le）主要分布在腎、膽囊、及乳汁中。FUCT-IV（類髓型）產(chǎn)物為Lex及VIM-2，存在于5～10周胚胎各組織，在成人僅在髓系組織及大腦中表達。FUCT-VI（血漿型）主要存在于肝臟和血漿，其產(chǎn)物為Lex和Slex。其中FUCT-VI催化合成Slex的能力可以是FUCT Ⅶ的1.5倍[12]。FUCT Ⅶ（白細胞型）在白細胞中表達，只能以唾液酸化的糖鏈為底物，合成Slex[13]。前期的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)UCT Ⅶ的活性可以直接影響Slex的表達量并進而影響肝癌細胞的黏附，趨化性遷移和侵襲等轉移表型[14]。用佛波脂（TPA，一種促癌劑，也是PKC蛋白激酶激活劑）處理Jurkat細胞觀察FUCT Ⅶ及其產(chǎn)物Slex表達的改變，結果發(fā)現(xiàn)處理后的細胞增加FUCT Ⅶ的轉錄及其產(chǎn)物Slex的表達，并能誘導合成E-選擇素配體合成[15]。我們的研究中發(fā)現(xiàn)，在腺癌組織，α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA表達量為（0.79±0.19），Slex表達陽性率為86%（31/36），均較強，表明在腺癌組織α1，3 FUCT Ⅶ可能是催化合成Slex抗原的主要FUCT。在鱗癌組織，α1，3 FUCT Ⅶ基因mRNA表達較弱（0.51±0.12），且與癌旁正常肺組織表達無顯著性差異（P#＞0.05），但Slex呈較強表達（陽性率為63.3%，19/30），表明在鱗癌組織中可能存在其他亞型的FUCT，以催化合成Slex。

然而，我們的實驗僅限于對非小細胞肺癌組織標本中α1，3 FUCTⅦ基因mRNA及Slex進行研究，驗證其與臨床病理因素的關系，至于α1，3 FUCT ⅦmRNA及Slex在肺癌中的作用機制尚未涉及，肺癌組織中是否還存在有其它的Lewis抗原，它們與α1，3 FUCT ⅦmRNA關系如何尚不清楚。因此，我們進一步需要研究在肺癌組織中Lewis抗原與其合成酶FUCT之間的關系，并結合相關細胞系及臨床結果來證實這種Lewis抗原及相關的糖鏈加工酶是否能成為腫瘤轉移的新的生物學指標和防止腫瘤轉移可能的治療靶點。

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