陳劍鋒，陳學(xué)松

（1.廣西壯族自治區(qū)岑溪市人民醫(yī)院，廣西 梧州 543200； 2.廣西壯族自治區(qū)梧州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 梧州 543002）

陽春片由人參、鹿茸、淫羊藿、山茱萸等組成，具補(bǔ)腎壯陽、生精益腦的功效，用于腎陽不足、腎精虧損引起的陽痿不舉、滑精早泄、失眠健忘、腎虛腰痛。為控制該制劑質(zhì)量，筆者對方中淫羊藿、山茱萸兩種藥材進(jìn)行了薄層鑒別，并采用高效液相色譜法測定淫羊藿中淫羊藿苷的含量，結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

LC-2010型高效液相色譜儀（日本島津）；GR-202型電子分析天平（日本AND）；CQX25-06型超聲波清洗器。熊果酸、淫羊藿苷對照品（中國藥品生物制品檢定所）；陽春片（市售品）；硅膠G、硅膠GF254（化學(xué)純，青島海洋化工廠）；其他化學(xué)試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

淫羊藿：取樣品3片，研細(xì)，加水15 mL，超聲處理15 min，濾過，濾液用乙酸乙酯提取2次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加入已處理好的聚酰胺柱（內(nèi)徑1 cm，聚酰胺粉2 g，干法裝柱）上，用乙酸乙酯20 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右宜嵋阴? mL使溶解，作為供試品溶液。另取缺淫羊藿的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。再取淫羊藿苷對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各5!L，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇 -水（10∶1∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖 1 A）。

山茱萸：取樣品15片，除去薄膜衣后研細(xì)，加硅藻土2 g，乙醇50 mL，置水浴上加熱回流10 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，加水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次15 mL，分取正丁醇液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，濾過，作為供試品溶液。另取缺山茱萸的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。再取熊果酸對照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對照品溶液。吸取上述3種溶液各4!L，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（24∶4∶0.5）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果供試品溶液色譜中，在與對照品溶液色譜相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照品溶液色譜中則無此斑點(diǎn)（圖1 B）。

圖1 薄層色譜圖

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：依利特 Hypersil-ODS2柱(250 mm×4.6 mm，5!m)；流動(dòng)相：乙腈 -0.1%磷酸（30 ∶70）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進(jìn)樣量：10!L。

2.2.2 溶液制備

精密稱取淫羊藿苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL含40!g的溶液，即得對照品溶液。取樣品10片，除去薄膜衣，精密稱定，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，蒸干，殘?jiān)铀?5 mL使溶解，用乙酸乙酯振搖提取5次，每次25 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量使溶解，并轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.45!m）濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。取缺淫羊藿的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備成陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各10!L，注入高效液相色譜儀。結(jié)果見圖2，表明在該色譜條件下，陰性對照品對測定無干擾。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：精密稱取淫羊藿苷對照品11.24 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密吸取上述對照品溶液1 mL，置10 mL量瓶中，分別加甲醇至刻度，搖勻，作為對照品溶液（質(zhì)量濃度為44.96!g/mL）。按擬訂的色譜條件分別吸取上述對照品溶液 1，2，5，10，50!L，注入色譜儀，測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）、淫羊藿苷對照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=172 549.8X+6 014.5，r=0.999 8（ n=5）。結(jié)果表明淫羊藿苷進(jìn)樣量在44.96～2 248 ng范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：取同一對照品溶液，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積積分值。結(jié)果的RSD=0.41%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，放置 0，2，4，6，8，10 h，按上述色譜條件分別測定峰面積積分值。結(jié)果的 RSD 為 0.77%（n=6），表明供試品溶液在10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

重現(xiàn)性試驗(yàn)：精密稱取同一批樣品共6份，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法測定含量。結(jié)果樣品中淫羊藿苷平均含量為0.178 mg/g，RSD=1.84%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量適量（淫羊藿苷含量為0.178 mg/g）的陽春片約0.5 g，研細(xì)，取粉末精密稱定，平行取樣6份。另取淫羊藿苷對照品4.62 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.092 4 g/L的溶液。分別精密吸取該溶液適量，分別加入6份樣品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

圖2 高效液相色譜圖

表1 淫羊藿苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.2.4 樣品含量測定

分別取3批樣品，按供試品溶液制備方法制備成溶液，在擬訂的色譜條件下進(jìn)行測定，計(jì)算含量。結(jié)果批號為 20070912，20070920，20071014的樣品中，淫羊藿苷的含量分別為0.194，0.155，0.212 mg/g。

3 討論

采用高效液相色譜法進(jìn)行含量測定前，曾對樣品前處理進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)如僅用乙醇提取，極性大的雜峰過多，會(huì)對淫羊藿苷峰造成一定的干擾，增加了液-液萃取步驟后，雜質(zhì)干擾明顯減少。對乙腈-0.1%磷酸[1]、乙腈-水[2]、甲醇-1%醋酸[3]等流動(dòng)相也進(jìn)行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-0.1%磷酸（30∶70）為流動(dòng)相得到的色譜峰峰形和分離度最好。

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[3]池玉梅，馮 亮，張愛華.HPLC法測定巴戟膠囊中淫羊藿苷含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，22(6):384-385.