何建鋒，郭瑞鋒，郄冰冰

（1.河北省邯鄲市中醫(yī)院，河北 邯鄲 056001； 2.河北省藥品檢驗所，河北 石家莊 050011）

復方地芬諾酯片是由鹽酸地芬諾酯2.5 mg和硫酸阿托品0.025 mg組成的復方制劑，2005年版《中國藥典（二部）》中分別采用兩種高效液相色譜（HPLC）系統(tǒng)測定兩組分含量，操作煩瑣。本試驗建立了一種能同時測定兩組分含量的HPLC法，方法簡便、快捷，結(jié)果準確、可靠，可很好地控制該產(chǎn)品的內(nèi)在質(zhì)量。

1 儀器與試藥

LC-2020A HT系列高效液相色譜儀，LC-solution色譜工作站（日本島津）；Sartorius BP211D分析天平。鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品對照品（中國藥品生物制品檢定所）；復方地芬諾酯片（河北賽克藥業(yè)有限公司，批號為 20060401，20060402，20060403)；十二烷基硫酸鈉、乙腈、磷酸均為色譜級，試驗用水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗[1]

色譜柱：島津VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm，5!m)；流動相：0.5%十二烷基硫酸鈉溶液（用70%磷酸調(diào)節(jié)pH至2.7）-乙腈（35 ∶65）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：210 nm ；進樣量：10!L。在此條件下，色譜圖見圖1。兩組分分離效果良好，與相鄰峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均不低于4 000。

圖1 高效液相色譜圖

2.2 溶液制備

精密稱取鹽酸地芬諾酯對照品10 mg，用流動相溶解并稀釋制成100!g/mL的溶液，作為對照品溶液"；精密稱取硫酸阿托品對照品10 mg，用流動相溶解并稀釋制成20!g/mL的溶液，作為對照品溶液#。取樣品細粉適量（約相當于鹽酸地芬諾酯100 mg，硫酸阿托品1 mg），置50 mL量瓶中，加流動相適量，充分振搖使溶解，加流動相稀釋至刻度，搖勻，濾過，作為供試品溶液"(此為硫酸阿托品含量測定濃度）；由于鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品規(guī)格相差較大，因此將供試品溶液"稀釋20倍后，作為供試品溶液#(此為鹽酸地芬諾酯含量測定濃度）。

2.3 方法學考察

輔料干擾試驗：按處方比例配制除待測組分的輔料空白樣品，依法測定。結(jié)果表明，輔料峰（2.5 min以前）與相鄰主峰分離良好，不干擾含量測定。

線性關(guān)系考察：精密量取2.2項下兩種對照品溶液各1，5，10，25，50!L，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進樣，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標進行線性回歸，得鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品的線性回歸方程分別為 Y1=2.500 0×104+3.304 6×104X1（r1=0.999 9）和Y2=1.623 4×103+1.334 8×104X2（r2=0.999 9）。結(jié)果表明，鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品質(zhì)量濃度分別在10.12～505.6!g/mL和2.36～118.0!g/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系均良好。

精密度試驗：分別取對照品溶液"和#各10!L，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算峰面積。結(jié)果鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品峰面積的 RSD分別為0.3%和0.4%（n=6），表明儀器精密度良好。

重現(xiàn)性試驗：取同一批號的樣品6份，精密稱定，依法測定兩組分含量。結(jié)果鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品含量的 RSD分別為0.5%和0.7%（n=6），表明方法重現(xiàn)性良好。

穩(wěn)定性試驗：取同一供試品溶液，分別于 0，2，4，6，8，12，24 h時進樣測定。結(jié)果鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品的 RSD分別為0.6%和0.8%（n=7），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗：精密稱定已知含量樣品（批號為20060401）6份，每份約含鹽酸地芬諾酯50 mg，分別精密加入鹽酸地芬諾酯對照品30，50，70 mg各2份，按供試品溶液制備方法制得待測溶液并測定，計算回收率。精密稱定已知含量樣品（批號為20060401）6份，每份約含硫酸阿托品0.5 mg，分別精密加入硫酸阿托品對照品0.3，0.5，0.7 mg各2份，按供試品溶液制備方法制得待測溶液并測定，計算回收率。結(jié)果見表1。

表1 鹽酸地芬諾酯及硫酸阿托品加樣回收試驗結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測定

取3批樣品，依法測定，按外標法以峰面積計算含量。結(jié)果3批樣品中每片含鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品分別為2.45 mg和24.6!g，2.44 mg 和 24.5!g，2.46 mg 和 24.8!g。

3 討論

由于硫酸阿托品僅有末端吸收，在此波長范圍鹽酸地芬諾酯也具有較強吸收，因此測定波長定為210 nm。因為鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品的極性差異太大，故在不加入離子對試劑或緩沖鹽的情況下，二者不可能在同一流動相條件下同時、合理出峰。經(jīng)試驗，加入緩沖鹽（磷酸二氫鉀）后會導致兩組分峰拖尾；加入離子對試劑可增強硫酸阿托品峰的保留性，在此基礎(chǔ)上增加流動相中有機相的比例，即可使二者同時出峰且保留時間合理，峰形和分離效果均較為滿意。因此，用0.5%十二烷基硫酸鈉溶液作為流動相的水相組成。曾在流動相中加入少量三乙胺，結(jié)果三乙胺對改善拖尾的作用不明顯，反而會導致峰形變寬，柱效降低，因此不使用三乙胺。當流動相pH＜3.5時，鹽酸地芬諾酯和硫酸阿托品峰能有效分離，保留時間趨于穩(wěn)定，峰形和分離度均較為理想；pH＞3.5時，二者雖能被同時分離，但拖尾嚴重，柱效均降低。因此，pH定在2.5～3.5之間較為合理。

硫酸阿托品對照品經(jīng)120℃干燥恒重后即為無水硫酸阿托品，故試驗測得的硫酸阿托品含量實為無水化合物含量。因為制劑中硫酸阿托品含量按一水化合物計算，所以測定結(jié)果需乘以二者的相對分子質(zhì)量之比1.027，方可得一水硫酸阿托品的含量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（二部）[M].北京：化學工業(yè)出版社，2005：425.