沈定榮,王 濤,張 青,馬 超,孟保英

先天性心臟病(congenital heart disease,CHD)是目前我國最常見的出生缺陷和嬰幼兒首位死因,早期手術(shù)是根治先心病、降低死亡率的唯一有效措施。由于嬰幼兒各臟器發(fā)育不成熟,心內(nèi)直視手術(shù)中的心肌保護及其術(shù)后心功能不全仍然是制約小嬰兒心血管手術(shù)發(fā)展的主要因素,未成熟心肌保護始終是國內(nèi)外學(xué)者研究的重點課題。

目前對未成熟心肌的定義還沒有統(tǒng)一明確的標準。一般把未成熟哺乳動物(羚羊 6天,豬齡 15天,新西蘭兔齡 4天,犬齡 8周)新生兒及嬰幼兒心肌稱為未成熟心肌[1]。盡管未成熟心肌與成熟心肌在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理功能及代謝特點上存在明顯差異,未成熟心肌與成熟心肌在組織、結(jié)構(gòu)、能量產(chǎn)生和利用及興奮收縮耦聯(lián)系統(tǒng)方面存在明顯的區(qū)別[2-4],但是許多醫(yī)院在心臟手術(shù)時都采用與成年患者基本相似的心臟停搏液,可能導(dǎo)致嬰幼兒未成熟心肌損傷。

常用的停搏液種類較多,各自特點不同,對未成熟心肌的保護效果差異顯著。本研究通過觀察自體冷血心臟停搏液與含血停搏液、St.Thomas液、HTK液灌注前、主動脈開放后 30min的心肌細胞三磷酸腺苷(ATP)及二磷酸腺苷(ADP)含量的變化,來評價自體冷血停搏液能否減輕缺血再灌注期未成熟心肌的損傷。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2007年6月到 2010年3月在我院收治的行體外循環(huán)室間隔缺損修補術(shù)的患兒80例 ,其中男 52例,女 28例 ;年齡 2.5～ 12(5.6)個月;體重 3.6～8.4(6.3)kg。隨機分為自體冷血停搏液組(A組,n=20)、冷血停搏液組(B組,n=20)、St.Thomas液組(C組,n=20)和 HTK液組(D組,n=20)。術(shù)前無肝腎功能異常、肺炎等合并癥,末梢血常規(guī)正常。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論通過,并經(jīng)監(jiān)護人知情同意。手術(shù)由同一組醫(yī)生、麻醉師、體外循環(huán)師合作完成。

1.2 主要試劑 ATP標準品(中國藥品生物制品檢驗所,批號 140674-200401),ADP標準品(Sigma公司,批號 048K7005)。

1.3 方法

1.3.1 心臟停搏液制備 A組:CPB開始前,經(jīng)主動脈根部按血液:晶體 4：1比例快速抽取血液,K+濃度 20 mmol/L,抽血時間約 30秒,保持動脈收縮壓≥30 mm Hg,停搏液制備完畢后,經(jīng)主動脈插管補充血容量以維持循環(huán)穩(wěn)定。B組:CPB開始后,經(jīng)氧合器按血液:晶體 4：1比例配制停搏液。C組:單純應(yīng)用St.Thomas液。D組:單純應(yīng)用 HTK液。停搏液配制后浸入冰屑液中制成 4℃冷停搏液備用。

1.3.2 體外循環(huán)及心肌保護 采用 JOSTRA人工心肺機,POLYSTAN膜式氧合器,全血預(yù)充,體外循環(huán)采用淺、中低溫(25～32℃),紅細胞比容(Hct)0.25～0.30。并行循環(huán)降溫,阻斷升主動脈,灌注心臟停搏液。

1.3.3 灌注方法 升主動脈阻斷后,按實驗設(shè)計分別經(jīng)主動脈根部灌注 4℃停搏液,劑量 30ml/kg,灌注壓力 30 mm Hg。

1.3.4 心肌取材 分別在主動脈阻斷前及主動脈開放后 30 min取右心耳 50 mg,迅速稱量后置入液氮中,移入-80℃冰箱保存。

1.3.5 樣品預(yù)處理 取出冷凍保存的心肌組織,加入 1 ml冷 0.42 mol/L HClO4溶液,制成組織勻漿后,冰浴放置 1 h,在 4℃下 14 000 r/min離心 15 min。上清液用 4.5 mol/L KOH溶液調(diào) pH為 7,再在 4℃下 14 000 r/min離心 15m in,上清液過濾后上機分析。

1.3.6 色譜分析條件 美國 Waters 2695 HPLC,Sepax Hp-C18色譜分析柱(5μm,4.6 mm×250 mm),柱溫 35℃,流動相為 50 mmol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.5),流速 1 ml/min,紫外線檢測波長 254 nm,樣品進樣體積 20μl。所有樣品上機前均過濾并再次離心。

2 結(jié) 果

2.1 臨床資料 兩組患兒的年齡、體重、CPB時間、主動脈阻斷時間比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05),見表1。

2.2 心肌 ATP、ADP含量 各組患兒主動脈阻斷前心肌 ATP與 ADP含量無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05);主動脈開放后 30 min均較阻斷前顯著減少(P＜0.01);A組患兒主動脈開放后 30min心肌 ATP與ADP含量較其他組顯著增高(P＜0.01)。見表2。

表1 兩組患兒臨床情況(n=20,±s)

表1 兩組患兒臨床情況(n=20,±s)

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表2 主動脈阻斷前、開放后30min心肌ATP、ADP含量的比較(μmol/mg,±s)

表2 主動脈阻斷前、開放后30min心肌ATP、ADP含量的比較(μmol/mg,±s)

注:同組術(shù)后與術(shù)前比較 *P＜0.05,**P＜0.01;各組與 A組比較 #組間比,P＜0.05,##P＜0.01

A組 1.45±0.41 0.94±0.40** 3.00±0.85 1.75±0.51**B組 1.42±0.48 0.66±0.36**## 2.62±1.03 1.08±0.45**##C組 1.50±0.35 0.45±0.28**## 2.90±0.95 0.83±0.69**##D組 1.54±0.28 0.59±0.30**## 2.78±0.93 1.12±0.41**##

3 討 論

主動脈阻斷、灌注停搏液后,心肌處于缺血、停搏狀態(tài)。主動脈再次開放后,隨著冠狀動脈再次通血、心臟復(fù)跳,產(chǎn)生了心肌缺血再灌注損傷,這與下列因素有關(guān):自由基生成增多;細胞內(nèi)鈣超載;白細胞趨化、黏附及對組織的損傷;高能磷酸化合物缺乏;內(nèi)皮素對心肌的損傷;血管緊張素Ⅱ(angiotensionⅡ)對組織的損傷。而在心肌缺血再灌注損傷過程中,激活心肌興奮收縮耦聯(lián)過程,導(dǎo)致肌原纖維攣縮,不但加速能量的消耗,其攣縮力可使肌纖維膜破裂。同時,Ca2+能以磷酸鈣的形式沉積于線粒體,損傷線粒體功能,使 ATP產(chǎn)生障礙。

短時間的缺血再灌注,心肌代謝可迅速改善并恢復(fù)正常,但較長時間的缺血后再灌注反而使心肌代謝障礙更為嚴重,ATP和磷酸肌酸(CP)含量迅速下降,氧化磷酸化障礙,線粒體不再對 ADP反應(yīng)。這是因為再灌注時自由基和鈣超載等對線粒體的損傷使心肌能量合成減少;加之再灌注血流的沖洗,ADP、AMP等物質(zhì)含量比缺血期降低,造成合成高能磷酸化合物的底物不足。本研究中也觀察到,各組患兒主動脈開放后心肌 ATP、ADP均降低,這與線粒體損傷、合成能量物質(zhì)能力下降,以及能量物質(zhì)底物減少有關(guān)。這說明了無論使用何種停搏液,均無法避免缺血-再灌注損傷。

本研究中,開放后 30min HTK液組心肌 ATP及ADP含量明顯高于 St.Thomas液組,提示 HTK液對所灌注的未成熟心肌能量物質(zhì)保護作用優(yōu)于后者。HTK液被公認為心肌保護效果最好的晶體停搏液,含有組氨酸/組氨酸鹽緩沖系統(tǒng)是其顯著特點。與其他緩沖系統(tǒng)相比,組氨酸對人體有較好的水溶性和分解能力,能較好地由毛細血管滲透到組織間隙而發(fā)揮作用。HTK液中含有的 α-酮戊二酸與色氨酸通過代謝均可生成 ATP,為缺血再灌注器官提供能量;同時,色氨酸作為膜穩(wěn)定劑,可防止組氨酸進入細胞內(nèi)。另外,HTK液含有甘露醇,作為羥自由基的清除劑,可防止氧自由基的損傷。

同樣,開放后 30min含血停搏液組心肌 ATP及ADP含量明顯高于 St.Thomas液組,提示含血停搏液對所灌注的未成熟心肌能量物質(zhì)保護作用優(yōu)于后者。與晶體停搏液相比,含血停搏液攜帶氧、可減少心臟停搏時冠狀動脈缺血缺氧。另外,它含有豐富的蛋白,具有穩(wěn)定的膠體滲透壓,可防止血管內(nèi)水分外滲。Illes等[5]通過含血停搏液和晶體停搏液的比較,發(fā)現(xiàn)前者的優(yōu)點不僅是向心肌提供氧,它還有更多的保護功能,如電解質(zhì)的緩沖作用,蛋白質(zhì)緩沖作用,自由基清除作用。有學(xué)者認為,含血停搏液在低溫灌注時,紅細胞在毛細血管內(nèi)聚集,灌注阻力增高。但龍村等[6]從光鏡中未發(fā)現(xiàn)上述情況;電鏡發(fā)現(xiàn)含血停搏液灌注更有利于心肌細胞超微結(jié)構(gòu)的保護。

開放后 30 min自體冷血停搏液組心肌 ATP及ADP含量明顯高于其他各組,提示灌注自體冷血停搏液可使未成熟心肌更有效地保存能量物質(zhì)。由于普通含血停搏液血液成分來源于體外循環(huán)管路,當心肺轉(zhuǎn)流后,血液與管道接觸,補體活化,激活大量中性粒細胞(PMN),再灌注過程中產(chǎn)生氧自由基,引起白細胞浸潤[7],使人體產(chǎn)生廣泛的炎性反應(yīng),導(dǎo)致無復(fù)流現(xiàn)象[8]。PMN可通過產(chǎn)生氧自由基或釋放蛋白水解酶直接激活補體。激活后的補體降解產(chǎn)物又是 PMN的趨化和活化刺激劑。同時補體 C3bi可使覆蓋在細胞上的細胞間黏附分子-1(ICAM-1)得到表達。ICAM-1表達后使 C3bi、內(nèi)皮細胞、ICAM-1三者更牢固結(jié)合,更有助于 PMN從微循環(huán)滲出并聚集在心肌組織中,促進炎性介質(zhì)釋放,誘導(dǎo)黏附分子表達,增加了血管腔的阻力,加重心肌再灌注損傷。

自體冷血停搏液直接取自主動脈根部的動脈血,因此避免上述反應(yīng)過程。在抽取主動脈根部血液過程中,主動脈收縮壓降至 30 mm Hg,持續(xù)時間約 30秒。停搏液配制完畢,由體外循環(huán)灌入等量血液,使血壓恢復(fù)至配停搏液前水平,再開始并行循環(huán)。因此,在心臟停搏前,出現(xiàn)短時間的全身器官灌注不足,即缺血預(yù)適應(yīng)(ischemic preconditioning,IPC)。國內(nèi)外許多學(xué)者認為 IPC對心肌的保護是迄今發(fā)現(xiàn)最強的內(nèi)源性保護,其確切機制尚不清楚。近來研究表明短暫缺血-再灌注產(chǎn)生的氧自由基、腺苷、一氧化氮、緩激肽和去甲腎上腺素等物質(zhì),與其相應(yīng)受體結(jié)合激活酪氨酸激酶與蛋白激酶 C(PKC),引起靶蛋白磷酸化及 ATP敏感鉀通道(KATP)的開放以達到保護效果[9-10]。延遲性保護機制涉及基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)的合成等,保護性蛋白,如超氧化物歧化酶(SOD)、熱休克蛋白(HSP)的表達可能是參與該保護性機制的重要環(huán)節(jié)[11]。

綜上所述,缺血再灌注損傷是體外循環(huán)下心內(nèi)直視手術(shù)心肌損傷的重要因素。手術(shù)中雖不能完全避免,但使用合適的停搏液以及恰當?shù)墓嘧⒎椒梢詼p輕其帶來的傷害。灌注自體冷血停搏液可使未成熟心肌更有效地保存能量物質(zhì),而足夠的能量物質(zhì)也是復(fù)跳后的心肌細胞維持正常功能的前提條件。這也進一步為我們提示了自體冷血停搏液可能具有良好的心肌保護效果,值得進一步研究及推廣。

[1]萬里飛,蘇肇伉,祝忠群,等.冷攣縮對未成熟心肌功能、能量代謝與超微結(jié)構(gòu)的影響[J].臨床心血管病雜志,1999,15(2):77-80.

[2]Diaco M,DiSesa VJ,Sun SC,et al.Cardioplegia for the immature myocardium.A comparative study in the neonatal rabbit[J].JThorac Cardiovase sury,1990,100(6):910-913.

[3]Julia PL,Kofsky ER,BuckbergGD,et al.Studiesofmyocardial protection in the immature heart.I.Enhanced tolerance of immature versus adultmyocardium to global ischem ia with reference tometabolic differences[J].JThorac Cardiovase Sury,1990,100(6):879-887.

[4]Kronon MT,Allen BS,Hernan J,etal.Superiority ofmagnesium cardioplegia in neonatalmyocardial protection[J].Ann Thorac Sury,1999,68(6):2285-2291.

[5]Illes RW,Silverman NA,K rukenkamp IB,et al.Upgrading acellular to sanguineous cardioplegic efficacy[J].J Surg Res,1989,46(6):543-548.

[6]龍村,岳紅文,郎亞軍,等.晶體停跳液和含血停跳液的臨床應(yīng)用研究[J].中國循環(huán)雜志,1996,11(4):221-225.

[7]王云,易定華,韓恩善,等.抑制心內(nèi)直視術(shù)中核轉(zhuǎn)錄因子激活保護心肌研究[J].中華試驗外科雜志,2006,23(7):885

[8]Fukushima S,Coppen SR,Varela-Carver A,et al.A novel strategy formyocardial protection by combined antibody therapy inhibiting both P-selectin and intercellular adhesionmolecule-1 via retrograde intracoronary route[J].Circulaion,2006,114(1 suppl):1251-1256.

[9]Inagaki K,Churchill E,Mochly-Rosen D.Epsilon protein kinase C as a potential therapeutic target for the ischemic heart[J].Cardiovasc Res,2006,70(2):222-230.

[10]Das B,Sarkar C.Sim ilaritiesbetween ischem ic preconditioning and 17beta-estradiol mediated cardiomyocyte KATP channel activation leading to cardioprotective and antiarrhythm ic effects during ischem ia/reperfusion in the intact rabbit heart[J].J Cardiovasc Pharmacol,2006,47(2):277-286.

[11]Riksen NP,Smits P,Rongen GA.Ischaemic preconditioning:from molecular characterisation to clinical application--part I[J].Neth JMed,2004,62(10):353-363.