繆 銘，張 濤，沐萬孟，江 波，金征宇

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

淀粉的支鏈精細結(jié)構(gòu)與消化性能

繆 銘，張 濤，沐萬孟，江 波，金征宇

(江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

采用高效液相排阻色譜技術(shù)探索不同淀粉中支鏈淀粉精細結(jié)構(gòu)與其慢消化性能的關(guān)系。結(jié)果表明：支鏈淀粉結(jié)構(gòu)中的鏈長分布FrⅠ(DP＞30)、FrⅡ(13＜DP＜30)均與慢消化淀粉(SDS)呈極顯著正相關(guān)(r＝0.909，P＜0.05；r＝0.847，P＜0.05)；FrⅢ(DP＜13)與SDS呈極顯著負相關(guān)(r=－0.869，P＜0.05)。支鏈淀粉的分支鏈長分布與淀粉低血糖特性關(guān)系密切，可采用基因工程調(diào)控淀粉鏈合成從而開發(fā)高營養(yǎng)品質(zhì)的新淀粉品種。

支鏈淀粉；精細結(jié)構(gòu)；慢消化性；鏈長；低血糖生成指數(shù)

淀粉是高等綠色植物中常見的貯藏性多糖，其結(jié)構(gòu)主要由直鏈狀和支叉狀分子組成的，前者是脫水葡萄糖單位間經(jīng)α-1,4糖苷鍵連接；后者支叉位置是α-1,6糖苷鍵連接，其余為α-1,4糖苷鍵連接，不同側(cè)鏈可分為A鏈(外鏈)、B鏈(內(nèi)鏈)和C鏈(主鏈)，這些側(cè)鏈形成雙螺旋簇狀結(jié)構(gòu)并堆積成結(jié)晶結(jié)構(gòu)[1-3]。同時，淀粉也是人類和大多數(shù)動物的主要能量來源，而淀粉消化的難易程度影響餐后血糖應(yīng)答，從而導(dǎo)致許多與飲食相關(guān)慢性疾病(如糖尿病、心血管疾病、糖原累積癥等代謝綜合癥)的出現(xiàn)[4-5]。依據(jù)體外模擬淀粉的消化速率，Englyst等[6]從營養(yǎng)學(xué)角度將其劃分為易消化淀粉(RDS)、慢消化淀粉(SDS)與抗性淀粉(RS)3類。其中，SDS與RS屬于低血糖食品，具有緩慢吸收、持續(xù)釋放能量，維持血糖穩(wěn)態(tài)，預(yù)防和治療各種疾病的特性[5]。

Zhang等[7-8]在研究報告提到淀粉的消化性能由結(jié)晶區(qū)域的分布和完整性決定，與淀粉分子形狀、大小，表面細孔以及淀粉結(jié)晶度沒有直接關(guān)聯(lián)。淀粉類食品消化速率的差異與其直鏈淀粉含量有關(guān)，但Panlasigui等[9]報道直鏈淀粉含量不能很好預(yù)測淀粉的消化速率，淀粉理化性質(zhì)(糊化)影響淀粉的消化性能和血糖應(yīng)答；而淀粉糊化特性與顆粒結(jié)構(gòu)有關(guān)，其中支鏈淀粉的長鏈部分[聚合度(DP)＞100]與糊黏度崩解值成負相關(guān)[10]。Guraya等[11]采用蠟質(zhì)淀粉經(jīng)普魯蘭酶脫支改性可制得SDS，Ao等[12]通過β-淀粉酶和麥芽糖α-淀粉酶部分縮短支鏈淀粉側(cè)鏈(A鏈與B鏈)和直鏈淀粉的長度來增加淀粉的分支密度和結(jié)晶結(jié)構(gòu)降低淀粉的消化速率，這些表明淀粉的精細結(jié)構(gòu)對淀粉的消化影響很大。本實驗對淀粉的支鏈精細結(jié)構(gòu)與消化性能進行分析探討，旨在為利用基因修飾技術(shù)培育高含量低血糖淀粉品種提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普通玉米淀粉、糯米淀粉 無錫泰花淀粉有限公司；蠟質(zhì)玉米淀粉 長春大成玉米開發(fā)有限公司；大米淀粉 江蘇寶寶集團公司；小麥淀粉 上海欣發(fā)調(diào)味食品廠；馬鈴薯淀粉 云南潤凱淀粉有限公司。

異淀粉酶 愛爾蘭Megazyme公司；豬胰α-淀粉酶 美國Sigma公司；GL-L NEW糖化酶 無錫Genencor Bio-Product公司；葡萄糖試劑盒(GOD-PAD) 愛爾蘭Megazyme公司；普魯蘭標(biāo)樣 瑞典Pharmacia公司；醋酸鈉、無水乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉等 國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultrahydrogel 120、250、500和1000高效液相排阻色譜柱 美國Waters公司；LC-10AT輸送泵、RID-10A折光檢測器 日本Shimadzu公司；SHA-2冷凍水浴恒溫振蕩器 江蘇億通電子有限公司；21E可見分光光度計 上海精密儀器儀表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 淀粉的預(yù)處理

支鏈淀粉的分離純化參照Takeda等[13]提取的方法。稱取1g淀粉，加入少量無水乙醇分散并濕潤樣品，再加入15mL 0.5mol/L的氫氧化鈉，在沸水浴中攪拌10min，冷卻后離心去掉分散物。用2mol/L的鹽酸中和離心液，加入10mL體積比為1:1的丁醇-異戊醇，在沸水浴中加熱攪拌10min后，冷卻至室溫，移入2～4℃冰箱中靜置24h，取出后高速離心，取上清離心液并加入10mL體積比為1:1的丁醇-異戊醇，沸水浴中加熱攪拌10min，冷卻至室溫，移入冰箱內(nèi)(2～4℃)靜置48h，于8000r/min高速離心10min，離心上清液中加2倍體積無水乙醇，靜置，離心，沉淀于50℃烘干，即得支鏈淀粉。

稱取10mg淀粉加入0.9mL蒸餾水，充分振蕩，95℃水浴加熱15min，然后冷卻至室溫，加入2.5mL 0.1mol/L的醋酸鈉緩沖液(pH4.0)后，加入5μL異淀粉酶(1000U/mL)，于40℃水浴保溫振蕩24h。脫支處理后的樣品離心取上清液，經(jīng)0.45μm的纖維素酯微孔膜過濾后進行HPSECRI分析。

1.3.2 色譜分析條件

選用Ultrahydrogel 120、250、500和1000水相高效液相排阻色譜柱串聯(lián)分析，流動相采用0.1mol/L NaNO3溶液，流速為0.6mL/min，流動相的折光指數(shù)取1.334，淀粉樣品的比折光指數(shù)增量dn/dc為0.160。使用柱溫箱將柱溫保持在40℃。

采用5種不同相對分子質(zhì)量的普魯蘭標(biāo)樣(MW41100、MW21400、MW13380、MW7100、MW2500)來校正柱子。脫支淀粉樣品的DP依據(jù)普魯蘭標(biāo)樣分子質(zhì)量MW計算，公式為DP＝MW/162。所得典型雙峰曲線通過峰值積分軟件分析確定FrⅠ(長鏈，DP＞30)、FrⅡ(中等長鏈和短鏈，13＜DP＜30)、FrⅢ(最短鏈，DP＜13)等不同鏈長部分比例。

1.3.3 淀粉的消化性能測定

淀粉不同的營養(yǎng)片斷分析是根據(jù)Englyst等[6]提出的體外模擬酶水解法進行了適當(dāng)改進。稱取200mg淀粉樣品置于測試管中，添加15mL pH5.2的0.2mol/L醋酸鈉緩沖液，混勻后沸水浴蒸煮處理20min，冷卻至室溫后加入10mL的豬胰α-淀粉酶(290U/mL)和糖化酶(15U/mL)，置于37℃恒溫水浴中振蕩(轉(zhuǎn)速為150r/min)并準(zhǔn)確計時。水解20min或120min后取出0.5mL水解液加4mL無水乙醇滅酶，然后離心處理后的上清液用葡萄糖氧化酶法在510nm波長處比色測定產(chǎn)生的葡萄糖含量。具體計算公式如下。

式中：m20為淀粉酶水解20min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；mFG為酶水解處理前淀粉中游離葡萄糖質(zhì)量/mg；m120為淀粉酶水解120min后產(chǎn)生的葡萄糖質(zhì)量/mg；mTS為樣品中總淀粉質(zhì)量/mg。

1.3.4 統(tǒng)計學(xué)相關(guān)分析

淀粉消化性能與支鏈淀粉中不同鏈長片斷雙變量的相關(guān)性采用SPSS12.0分析軟件中的Pearson簡單相關(guān)系數(shù)來評價。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉的支鏈精細結(jié)構(gòu)分析

圖1 異淀粉酶脫支處理淀粉的色譜圖Fig.1 Chromatogram of isolated and debranched amylopectin from different starches

不同淀粉品種的支鏈淀粉經(jīng)異淀粉酶脫支，然后過凝膠色譜柱分析，得支鏈淀粉分支鏈長分布，圖1是經(jīng)脫支處理后不同支鏈淀粉分支鏈的色譜圖，F(xiàn)rⅠ、FrⅡ和FrⅢ是根據(jù)鏈長或聚合度大小定義的(由大到小)，各峰所占面積的比率如表1所示。除小麥淀粉的分支鏈分布為三峰曲線外，其他如普通玉米淀粉、蠟質(zhì)玉米淀粉、糯米淀粉、大米淀粉和馬鈴薯淀粉均表現(xiàn)雙峰曲線，這與Hizukuri報道的結(jié)論基本一致[2-3]。

表1 淀粉脫支色譜圖中不同鏈長部分的面積Table 1 Area of FrI, FrII and FrIII in chromatograms of debranched amylopectin from different starches %

不同品種支鏈淀粉的長鏈與短鏈分配的比率存在明顯的差異，在供試谷物淀粉中，蠟質(zhì)玉米淀粉的支鏈含較多長鏈(FrⅠ+FrⅡ)，大米淀粉含有較多短鏈(FrⅢ)。依據(jù)側(cè)鏈各自的長度和跨越的簇的數(shù)量，在支鏈淀粉分子內(nèi)典型A鏈的聚合度為小于13(最短鏈)，B1鏈的聚合度為13～30(中等長鏈和短鏈)，B2、B3等鏈的聚合度大于30(長鏈)[2-3]。因此，可推斷出蠟質(zhì)玉米支鏈淀粉中含有高比例的B1鏈，其次是B2、B3等鏈，A鏈最少。不同淀粉的支鏈分布的差異原因可能與供試的品種不同有關(guān)，如合成淀粉的酶、環(huán)境因素等。

2.2 淀粉的消化性能分析

根據(jù)消化時間不同，淀粉可劃分RDS、SDS與RS 3種片斷，其中，RDS食用后產(chǎn)生高血糖應(yīng)答，易產(chǎn)生胰島素抗性，SDS持續(xù)緩慢釋放葡萄糖，具有低血糖食品的特性，而RS只在大腸中發(fā)酵產(chǎn)生短鏈脂肪酸，有利于腸道健康[4-5]。因此，SDS與RS均可以改善淀粉的營養(yǎng)品質(zhì)。

圖2 淀粉中不同營養(yǎng)片斷的生物可利用性分類Fig.2 Bioavailability classification of nutritional starch fractions

由圖2可以看出，淀粉在蒸煮處理后主要含RDS，而SDS與RS的量很少。根據(jù)Fernandes等[14]與Zhang等[7-8]的研究報道，A型結(jié)構(gòu)的天然谷物淀粉是理想的SDS材料(約50%)，B型結(jié)構(gòu)的天然馬鈴薯淀粉屬于高RS(76%)，這說明淀粉的營養(yǎng)片斷與其結(jié)晶結(jié)構(gòu)有關(guān)。蒸煮處理使不同來源淀粉中SDS與RS差異基本消失并轉(zhuǎn)化成RDS而導(dǎo)致其比例增大，這可能使加熱過程完全破壞天然淀粉粒的半結(jié)晶結(jié)構(gòu)。不同品種的玉米或米淀粉含有SDS與RS的比例不同，這表明可以采用基因突變方法可以來改變淀粉的營養(yǎng)品質(zhì)，而且最有效的方法是降低RDS來提高SDS或RS。

2.3 相關(guān)性分析

表2 淀粉鏈長片斷與消化性能的相關(guān)性Table 2 Correlation between amylopectin chain fractions and digestibility of different starches

由表2相關(guān)性分析可以看出，支鏈淀粉的分支鏈鏈長分布與淀粉的SDS片斷密切相關(guān)。其中FrⅠ、FrⅡ均與SDS呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.909和0.847；FrⅢ與SDS呈極顯著負相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為－0.869。這說明支鏈淀粉含的長鏈越多，淀粉中SDS片斷的含量越高。分析其原因可能是分支淀粉長鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)與蛋白、脂質(zhì)相互作用形成復(fù)合物，抑制淀粉的膨脹，同時，支鏈淀粉含有的長鏈可使糊化過程中支鏈淀粉結(jié)構(gòu)不易破裂，而維持膠稠化的淀粉顆粒結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致SDS含量較高[5,10]。因此支鏈淀粉含長鏈(FrⅠ與FrⅡ)比例越高，淀粉顆粒不易充分糊化，保持淀粉的慢消化性能。

支鏈淀粉精細結(jié)構(gòu)通過可溶性淀粉合成酶(SSS)、淀粉分支酶(SBE)與淀粉脫支酶(DEB)來調(diào)節(jié)合成，支鏈淀粉側(cè)鏈A鏈只受SBE單獨調(diào)控，而B鏈則受SBE 和SSS雙重控制，而淀粉支鏈簇狀結(jié)構(gòu)則由DBE 和SBE兩者活性相互協(xié)調(diào)形成[15-16]。支鏈淀粉分布模式與鏈長可通過抑制或表達這3種酶活性來實現(xiàn)工程化。因此，采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)可在不影響淀粉產(chǎn)量的基礎(chǔ)上調(diào)控淀粉的構(gòu)成，從而可以改良淀粉營養(yǎng)品質(zhì)(低血糖應(yīng)答)。

3 結(jié) 論

以不同來源的淀粉為原料，通過凝膠色譜技術(shù)測定淀粉支鏈精細結(jié)構(gòu)中分支鏈的鏈長分布，同時分析其與淀粉消化性能之間的關(guān)系。支鏈淀粉中含長鏈(FrⅠ與FrⅡ)比例越高，糊化后淀粉中SDS片斷越多。因此，本實驗可以為開發(fā)低血糖淀粉提供一種新的方法，即采用基因改性法來生產(chǎn)新的功能性淀粉。

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Relationship between Fine Structure of Amylopectin and Digestibility from Cereal Starch

MIAO Ming，ZHANG Tao，MU Wan-meng，JIANG Bo，JIN Zheng-yu
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The correlation between starch digestibility and fine structure of amylopectin was investigated in this study. Slowly digestible starch (SDS) fraction was positively correlated (r = 0.909, P ＜ 0.05; r = 0.847, P ＜ 0.05) with FrI (DP ＞ 30) and FrII(13 ＜ DP ＜ 30), respectively, and negatively correlated (r = － 0.869, P ＜ 0.05) with FrIII (DP ＜ 13). Thus, the chain length distribution of debranched amylopectin exhibited a relationship with low glycemic index. These investigations revealed a molecular basis of fine structural variability in amylopectin for starch digestion property and could provide a strategy to develop raw starch materials with high nutritional value.

amylopectin； fine structure；digestibility；chain length；low glycemic index

TS201.23

A

1002-6630(2010)09-0012-04

2009-09-28

國家自然科學(xué)基金項目(20976073)；“十一五”國家科技支撐計劃項目(2006BAD05A07-A-02)；江蘇省自然基金創(chuàng)新學(xué)者攀登項目(BK2008003)；江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室目標(biāo)導(dǎo)向資助項目(SKLF-MB-200804)；江南大學(xué)自主科研計劃資助項目(JUSRP10930)

繆銘(1980—)，男，副教授，博士，研究方向為功能性碳水化合物。E-mail：miaoming@jiangnan.edu.cn