祝 婷，李成磊，吳 琦﹡，蒙 華，陳 惠，邵繼榮

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

苦蕎和甜蕎二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)的克隆及序列分析

祝 婷，李成磊，吳 琦﹡，蒙 華，陳 惠，邵繼榮

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與理學(xué)院，四川 雅安 625014)

采用同源基因克隆的方法，以苦蕎和甜蕎葉片為材料，提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得其二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)cDNA序列，并通過T載體克隆后測序。序列分析表明，獲得了苦蕎和甜蕎dfr的全長cDNA編碼序列，其1026bp的全長開放閱讀框(ORF)均編碼341個氨基酸，并具典型的dfr結(jié)構(gòu)特征和功能模塊。同源性分析顯示，苦蕎和甜蕎與其他植物的dfr基因核苷酸相似性為71%～98%；根據(jù)氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹表明，二者與豆科、?？坪退N薇科聚為一類。

苦蕎；甜蕎；二氫黃酮醇4-還原酶基因；克隆；序列分析

蕎麥?zhǔn)鞘澜缟弦环N重要的雜糧作物，它屬于蓼科(Polygonaceae)、蕎麥屬(FagopyrumMill)雙子葉禾谷類作物，主要栽培種有甜蕎(F. esculentumMoench也稱普通蕎麥)和苦蕎(F. tartaricum(L.) Gaertn又稱韃靼蕎麥)[1]。蕎麥的蛋白質(zhì)含量很高，主要有谷蛋白、水溶性清蛋白和鹽溶性球蛋白等，其質(zhì)量均優(yōu)于大米、小麥、高粱和玉米，尤其是在苦蕎中，這3種蛋白占蛋白質(zhì)總量的50%以上[2]。18種氨基酸中，蕎麥不僅有人體必需的8種氨基酸，更有谷類作物最缺少的賴氨酸[3]。加上它們均含有豐富的微量元素、維生素、食物纖維和多種礦物質(zhì)以及蘆丁等生物類黃酮，可起到降低血液膽固醇、治療高血壓、控制糖尿病和微血管脆弱引起的出血病、防治便秘、延緩衰老等作用[4-5]，被譽(yù)為新型的綠色保健食品。目前在開發(fā)利用方面已有生物類黃酮散、生物類黃酮軟膏、生物類黃酮膠囊、生物類黃酮牙膏以及生物類黃酮口香糖等產(chǎn)品。隨著人們膳食結(jié)構(gòu)的不斷改善，以蕎麥特別是苦蕎為原料的系列保健長壽食品將在人們生活中起到重要的作用。

二氫黃酮醇4-還原酶(dihydroflavonol 4-reductase，DFR)是花色素苷和原花色素生化合成途徑中的關(guān)鍵酶。1985年，O’Reilly等[6]采用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法首次從玉米和金魚草中分離了dfr基因。隨后，Beld等[7]以金魚草DFR基因為探針獲得了矮牽牛dfr基因。至今人們從多種植物如擬南芥、西紅柿、玫瑰、葡萄、水稻、百合等分離出了d fr基因。原花色素(o l i g o m e ri c proanthocyanidins，OPCs)為多羥基酚類化合物，衍生于黃烷類化合物，屬生物類黃酮，具有獨(dú)特的化學(xué)和藥理活性。本研究以苦蕎和甜蕎為材料，采用RT-PCR技術(shù)克隆其dfr基因的cDNA序列，對了解蕎麥花色素苷和原花色素生化合成途徑及蕎麥主要活性成分代謝的分子機(jī)制和在藥用次生代謝產(chǎn)物代謝過程中的作用有重要的意義，以期為發(fā)展花色基因工程和開發(fā)新型藥物提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦蕎和甜蕎種子購于四川阿壩農(nóng)戶，種植于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生物系實(shí)驗基地。經(jīng)邵繼榮教授鑒定，二者分別是圓?？嗍w和太平甜蕎。

R N Aout試劑盒 天澤基因工程有限公司；RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒 Fermentas公司；2×TaqPCR Master Mix 北京TIANGEN生物公司；無菌去離子水 實(shí)驗室自制；Gel Extraction Kit Omega公司；pMD19-T simple Vector 寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Thermo MicroLite RF 220/240高速冷凍離心機(jī) 美國熱電公司；MyCyclerTMThermal Cycler PCR儀、S.N.76S凝膠成像系統(tǒng) 美國BIO-RAD公司；DYY-Ⅲ-68型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀 北京市六一儀器廠；DNP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱 上海精宏試驗設(shè)備有限公司。

1.3 總RNA提取及dfr基因cDNA的克隆

采用植物RNAout試劑盒提取蕎麥葉片的總RNA，電泳檢測。采用RevertAidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒進(jìn)行RT-PCR合成cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系總體積為20μL，含總RNA 4μL、Oligo-dTPrimer(0.5μg/μL) 1μL、DEPC H2O 7μL、5×reaction buffer 4μL、RiboLockTMRiobonuclease Inhibitor 1 μ L和10mmol/L dNTP mix 2μL，最后加入1μL Revert AidTM M-MuLV Reverse Transcriptase。反應(yīng)條件：42℃ 60min將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第一鏈，70℃ 10min熱滅活反轉(zhuǎn)錄酶，將合成產(chǎn)物保存于－80℃冰箱備用。

以合成的cDNA為模板進(jìn)行dfr基因cDNA全長克隆。參照NCBI登錄的金蕎麥(Fagopyrum cymosum)dfr基因(EF522145)全長的5'端和3'端UTR序列設(shè)計一對引物，上游引物5'-CTTTTCTCACCAAAACGACG-3'，下游引物5'-TTCTCACAAAAGTAAAACTAATCAA-3', 由上海英駿生物公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積為25μL，含2×TaqPCR Master Mix 12.5μL，10mmol/L 引物各1μL，DNA模板1μL和無菌去離子水9.5μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性50s、55℃退火50s、72℃延伸90s、35個循環(huán)，72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，采用Gel Extraction Kit回收后，與pMD19-T simple Vector連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選陽性克隆，穿刺管培養(yǎng)后，送北京諾賽基因公司測序。

1.4dfr基因的序列分析

將測序結(jié)果拼接后，在GenBank進(jìn)行生物信息學(xué)分析。應(yīng)用DNAMAN軟件對推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行多序列比對，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥總RNA的提取

提取的總RNA的電泳檢測結(jié)果見圖1。圖1中各泳道可清晰觀察到28S RNA、18S RNA和mRNA 3條區(qū)帶，且28S RNA和18S RNA兩者比例符合2:1的特點(diǎn)，表明提取的RNA較為完整，質(zhì)量較高，可用于RTPCR。

圖1 蕎麥總RNA的電泳檢測Fig.1 Electrophoresis patterns of total RNA from tartary buckwheat and common buckwheat

2.2dfr基因的擴(kuò)增及序列分析

圖2 dfr基因全長cDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 Full length PCR amplification products of dfr genes from tartary buckwheat and common buckwheat

將苦蕎和甜蕎的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，再經(jīng)PCR擴(kuò)增，均得到約1200bp的特異性條帶，結(jié)果見圖2。序列分析表明，苦蕎d f r基因的c D N A長度為1185bp，包含1026bp的完整開放閱讀框(ORF)，在NCBI Genebank的登錄號為GU169468, 將該序列命名為Ftdfr；甜蕎dfr基因的cDNA長度為1192bp，包含1026bp的完整開放閱讀框(ORF)，在NCBI Genebank的登錄號為GU169469，將該序列命名為Fedfr。Ftdfr和Fedfr均編碼一個含341氨基酸殘基的蛋白質(zhì)(圖3)。經(jīng)在線蛋白質(zhì)分析服務(wù)器(http://www.expasy.org/cgi-bin/protparam)分析表明，F(xiàn)tdfr相對分子質(zhì)量為38.53，推測的等電點(diǎn)(pI)為5.78；Fedfr相對分子質(zhì)量為38.55，推測的等電點(diǎn)(pI)為5.60。此外，在Ftdfr和Fedfr起始密碼子ATG附近存在CCATGG序列，與參與真核生物翻譯起始的Kozak保守序列(A/GXXATGG)一致。

圖3 Ftdfr與Fedfr的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列比較Fig.3 Comparison of cDNA sequences and deduced amino acid sequences between dfr genes from tartary buckwheat and common buckwheat

2.3 植物dfr的序列比對與進(jìn)化分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站對Ftdfr進(jìn)行Blastn比對分析，結(jié)果表明該基因的核苷酸序列與其他植物的dfr基因的相似性較高，與金蕎麥(Fagopyrum cymosum)、甜蕎(Fagopyrum esculentum)、水蓼(Persicaria hydropiper)、單籽山楂(Crataegus monogyna)、蘋果(Malus x domestica)、西洋梨(Pyrus communis)、美洲商路(Phytolacca americana)、瞿麥(Gypsophila elegans)、菠菜(Spinacia oleracea)和苜蓿(Medicago truncatula)等的dfr基因相似性均在71%～98%之間，其中與金蕎麥相似性最高，為98%(表1)。

表1 Ftdfr與其他植物dfr基因的同源性比較Table 1 Homologous comparison of nucleotide sequences among dfr genes from tartary buckwheat and other plant species

以苦蕎ORF序列推導(dǎo)的蛋白質(zhì)序列進(jìn)行BLASTp分析結(jié)果表明，苦蕎dfr基因編碼蛋白與其他植物的二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)有高度同源性，其中與金蕎麥dfr同源性最高為98%。利用DNAMAN軟件將Ftdfr與Fedfr推導(dǎo)的氨基酸序列與同源蛋白進(jìn)行多序列比對(圖4)，發(fā)現(xiàn)在DFR蛋白質(zhì)序列中存在一個NADP(H)結(jié)合保守區(qū)域VTGASGFVGSWLVMRLLEHGY，還存在一個底物特異性結(jié)合保守區(qū)域TVNVEEKQKPVYDETCWSDV DFCRRV。比對結(jié)果表明二者與金蕎麥、蘋果、美洲商路、石竹、擬南芥等在DFR蛋白氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化上有高度保守性。

圖4 FtDFR和FeDFR與其他植物DFR的氨基酸序列比對Fig.4 Amino acid sequence alignment among dfrgenes from tartary buckwheat and common buckwheat and other plant species

圖5 不同植物DFR氨基酸序列的進(jìn)化樹Fig.5 Phylogenetic tree based on amino acid sequence encoded by dfr gene in different plant species

基于Ftdfr和Fedfr氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明這些植物共聚為3大類，蓼科的苦蕎、甜蕎和金蕎，豆科的苜蓿和黃豆，?？频钠【苹?，薔薇科的蘋果、單籽山楂和西洋梨聚為一類，商路科的美洲商路，藜科的菠菜，石竹科的瞿麥和石竹聚為一類，十字花科的擬南芥和玄參科的金魚草為另一類。其中，苦蕎與金蕎麥的同源關(guān)系最近，其次是甜蕎。

3 討 論

3.1 二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)是花色素苷生化合成途徑中的關(guān)鍵酶，是一個重要的調(diào)控點(diǎn)。它催化二氫黃酮醇在C4位發(fā)生立體特異的還原反應(yīng)[8]，繼而在花色素苷合成酶(anthocyanin synthase，ANS)和類黃酮3-O-糖基轉(zhuǎn)移酶(flavonoid 3-O-glucosyltransferase，3GT)的作用下合成各種花色素苷[9]。因此，DFR 是將二氫黃酮醇轉(zhuǎn)變?yōu)榛ㄉ剀辗磻?yīng)的第一個酶，這一反應(yīng)需要NADP (H)。在不同的物種中，DFR與NADP(H)的結(jié)合區(qū)域“VTGAAGFIGSWLIMRLLERGY”是高度保守的[10]。不同物種的DFR對底物選擇性和表達(dá)水平的不同促使不同花色素的合成。關(guān)于底物選擇特異性的分子機(jī)制，早期的研究者提出了一個26個氨基酸的底物特異選擇的結(jié)構(gòu)域[7]，DFR對不同底物的結(jié)合是由其分子中底物結(jié)合區(qū)的氨基酸序列所決定，這個序列在不同物種中也是高度保守的[11]。該結(jié)合區(qū)132 位與 141 位的氨基酸可直接影響酶的底物特異性，大多數(shù)物種在132 位含有D(天冬氨酸)或N(天冬酞胺)，分別被稱為Asp型DFR和Asn型DFR；還有一類DFR的第132位氨基酸殘基既不是天冬氨酸也不是天冬酰胺，因此被稱為非Asn/Asp型DFR[12]。在植物中Asn型DFR分布廣泛，單子葉植物都是Asn型DFR，而Asp型DFR只分布在部分雙子葉植物中。此外，只有少數(shù)植物含有非Asn/Asp型DFR[13]，并且在進(jìn)化上分布較遠(yuǎn)，由此推測Asp型和非Asn/Asp型DFR有可能是由Asn型DFR進(jìn)化而來。本研究中苦蕎和甜蕎均屬雙子葉植物，而且DFR氨基酸序列的132位為N，則推測其為Asn型DFR，且具有底物選擇特異性。

3.2 金蕎與甜蕎和苦蕎之間的親緣關(guān)系是蕎麥屬種間親緣關(guān)系爭論的焦點(diǎn)。Steward[14]、Suvorova等[15]和王莉花等[16]認(rèn)為金蕎與甜蕎之間的親緣關(guān)系比與苦蕎的親緣關(guān)系近。Kishima等[17]、Sharma等[18]和趙佐成等[19]認(rèn)為金蕎與苦蕎的親緣關(guān)系比與甜蕎的親緣關(guān)系近。這可能是由于各學(xué)者所采用的材料不同或者是野生種不同種群間遺傳差異等造成。本研究通過比較不同植物DFR氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹表明金蕎和苦蕎的親緣關(guān)系與金蕎和甜蕎的親緣關(guān)系相比較更近。可見，分析同源蛋白的結(jié)構(gòu)對研究種屬和種間差異也具有重要意義。

3.3dfr基因已在多種植物中得到分離，其分子特征和調(diào)控機(jī)制也得到了深入研究，發(fā)現(xiàn)它通常是單基因和小基因家族[8]。已報道的dfr基因為單基因的植物有擬南芥[20]和金魚草[21]等。植物基因啟動子是重要的順式作用元件，位于結(jié)構(gòu)基因5′端上游，指導(dǎo)酶與模板的正確結(jié)合，活化RNA聚合酶，決定轉(zhuǎn)錄起始部位和轉(zhuǎn)錄效率，影響基因的表達(dá)。本研究在首次克隆苦蕎和甜蕎中dfr基因的全長cDNA編碼序列的基礎(chǔ)上，擬進(jìn)一步對其啟動子和基因表達(dá)調(diào)控等進(jìn)行深入研究。

由于蕎麥含有獨(dú)特生物活性成分，具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值，蕎麥制品正日益受到人們的青睞[22]。我國蕎麥資源豐富，利用生物技術(shù)擴(kuò)展對dfr的研究對于黃酮代謝途徑工程的研究和保健食品等的開發(fā)具有重要作用。

[1] 顧堯臣. 小宗糧食加工(四): 蕎麥加工[J]. 糧食與飼料工業(yè), 1999(7): 19-22; 26.

[2] 張宏志, 管正學(xué). 蕎麥資源在我國的開發(fā)利用[J]. 自然資源, 1996(4): 38-44.

[3] 羅中旺, 李鳳英, 王桂珍. 中國苦蕎生產(chǎn)開發(fā)現(xiàn)狀及內(nèi)蒙古自治區(qū)苦蕎發(fā)展設(shè)想[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技, 2005(6): 17-19.

[4] KAYASHITA J, SHIMAOKA I, NAKAJOH M, et al. Consumption of buckwheat protein lowers plasma cholesterol and raiscs fecal neut ral sterols in cholesterol-fed rats because of its low digestibility[J]. The Journal of Nutrition, 1997, 127(7): 1395-1400.

[5] KAYASHITA J, SHIMAOKA I. Consumption of a buckwheat protein extract relards 7,12-dimethylbenz [.alpha.] anthracene-induced mammary carcinogenesis in rats[J]. Biosci Bio Biochem, 1999, 63(10): 1837-1839.

[6] O’REILLY C, SHEPHERD N S, PEREIRA A, et al. Molecular cloning of the allocus inZea maysusing the transposable elements En and Mul[J]. EMBO Journal, 1985, 4(4): 877-882.

[7] BELD M, MARTIN C, HUITS H, et al. Flavonoid synthesis inPetunia hybrida: partial characterization of dihydroflavonol 4-reductase genes[J]. Plant Mol Biol, 1989, 13(5): 491-502.

[8] 劉光德, 雷興華, 祝欽瀧, 等. 金蕎麥二氫黃酮4-還原酶基因(Fdfr1)的克隆及序列分析[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué), 2009, 42(1): 55-63.

[9] 劉娟, 馮群芳, 張杰. 二氫黃酮醇4-還原酶基因(dfr)與花色的修飾[J]. 植物生理學(xué)通訊, 2005, 41(6): 715-719.

[10] JOHNSON E T, YI H, SHIN B, et al. Cymbidium hybrida dihydroflavonol 4-reductase does not efficiently reduce dihydrokaempferol to produce pelargonidin-type anthocyanins[J]. Plant J, 1999, 19(1): 81-85.

[11] POLASHOCK J J, GRIESBACH R J, SULLIVAN R F, et al. Cloning of a cDNA encoding the cranberry dihydroflavonol 4-reductase(DFR) and expression in transgenic tobacco[J]. Plant Sci, 2002, 163(2): 241-251.

[12] JOHNSON E T, RYU S, YI H, et al. Alteration of a single amino acid changes the substrate of dihydroflavonol 4-reductase[J]. Plant J, 2001, 25(3): 325-333.

[13] 李春雷, 崔國新, 許志茹, 等. 植物二氫黃酮醇4-還原酶基因的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通訊, 2009, 20(3): 442-445.

[14] STEWARD A N. The Polygoneae of eastern Asia[J]. Contrib GrayHerb Harv Univ, 1930, 88: 117-129.

[15] SUVOROVA G N, FUNATSUKI H, TRAMI F. Phylogenetic relationships among cultivars, species and hybrids in the genusFagopyrumMill. assessed by RAPD analysis[J]. Russian Journal of Genetics, 1999, 35(12): 1428-1432.

[16] 王莉花, 殷富有, 劉繼海, 等. 利用RAPD分析云南野生蕎麥資源的多樣性和親緣關(guān)系[J]. 分子植物育種, 2004, 2(6): 807-815.

[17] KISHIMA Y, OGURA K, MIZUKAMI K, et al. Chloroplast DNA analysis in buckwheat species: Phylogenetic relationships, origin of the reproductive systems and extended inverted repeats[J]. Plant Sci, 1995, 108(2): 173-179.

[18] SHARMA R, JANA S. Species relationships inFagopyrumrevealed by PCR-based DNA fingerprinting[J]. Theor Appl Genet, 2002, 105(2/3): 306-312.

[19] 趙佐成, 周明德, 羅定澤, 等. 中國蕎麥屬果實(shí)形態(tài)特征[J]. 植物分類學(xué)報, 2000, 38(5): 486-489.

[20] SHIRLEY B W, HANLEY S, GOODMAN H M. Effects of ionizing radiation on a plant genome: analysis of twoArabidopsistransparent testa mutations[J]. Plant Cell, 1992, 4(3): 333-347.

[21] HOLTON T A, CORNISH E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell, 1995, 7(7): 1071-1083.

[22] 趙小珍, 張政, 景巍, 等. 苦蕎麥主要過敏蛋白N端基因片段的克隆及序列分析[J]. 食品科學(xué), 2006, 27(10): 41-44.

Cloning and Sequence Analysis of Dihydroflavonol 4-Reductase Genes from Tartary Buckwheat and Common Buckwheat

ZHU Ting，LI Cheng-lei，WU Qi*，MENG Hua，CHEN Hui，SHAO Ji-rong
(College of Life Science, Sichuan Agricultural University, Ya’an 625014, China)

The cDNA sequence of dihydroflavonol 4-reductase (DFR) gene was amplified from total RNA from the leaves of tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum) and common buckwheat (Fagopyrum esculentum) by RT-PCR using homology-based cloning strategy. The amplified fragments were then cloned into T-vector. Sequence analysis indicated that both cDNAs had open reading frames of 1026 bp in full length, which encoded a polypeptide composed of 341 amino acids with typical structure characteristics and functional module of DFR enzyme, respectively. The nucleotide similarity ofdfrgene amongFagopyrum tataricum,Fagopyrum esculentumand other plants ranged from 71% to 98%. In addition, the phylogenetic analysis based on amino acid sequence enconded bydfrgene indicated that both buckwheat varieties,Leguminosae,Moraceae andRosaceaewere classified into one class.

Fagopyrum tataricumGaertn；Fagopyrum esculentumMoench；dihydroflavonol 4-reductase (dfr) gene；cloning；sequence analysis

Q943.2

A

1002-6630(2010)13-0219-05

2009-12-29

四川省科技廳科技攻關(guān)項目(04NG001-015；2006Z08-012)

祝婷(1985—)，女，碩士研究生，研究方向為基因工程。E-mail：wuyutingpeng@126.com

﹡通信作者：吳琦(1973—)，男，副教授，博士，研究方向為酶工程。E-mail：wuqiwq@yahoo.cn