寧德生，梁小燕，方 宏

(廣西壯族自治區(qū)、中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

高效液相色譜法對(duì)羅漢果中VC含量的檢測

寧德生，梁小燕，方 宏

(廣西壯族自治區(qū)、中國科學(xué)院廣西植物研究所，廣西 桂林 541006)

目的：建立HPLC色譜法測定羅漢果中VC含量的方法。采用5g/L草酶對(duì)羅漢果浸提15min，對(duì)提取液中VC進(jìn)行檢測，具體方法：采用SinoChrom ODS-BP(250mm×4.6mm，5μm)分離；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2，V/V)；流速1.0mL/min；采用二極管陣列多波長檢測器確定VC的最大吸收波長為242nm；測定溫度25℃；進(jìn)樣量10μL。結(jié)果表明：VC溶液0.08～0.50mg/mL范圍線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r=1；回收率為99.3%，RSD為1.93%。結(jié)論：該方法操作簡便快速，精密度和穩(wěn)定性好，適用于羅漢果VC含量的測定。

羅漢果；HPLC；VC

羅漢果(Siraitia grosvenorii(Swingle)C. Jeffrey)為葫蘆科(Cucurbitaceae)羅漢果屬植物的成熟果實(shí)，主產(chǎn)于廣西永福、臨桂和龍勝等地，是廣西著名特產(chǎn)。羅漢果性涼、味甘、無毒，有潤肺止咳、清熱解暑、涼血健胃、潤腸通便的功效，在治療咽喉炎、百日咳、急慢性氣管炎、胃腸疾病方面療效顯著[1-3]。羅漢果中除了含有一系列的三萜及三萜皂苷成分外[4]，還含有豐富的VC[5]。

目前，常用于測定VC的方法有2,6-二氯靛酚滴定法、碘滴定法、鉬藍(lán)比色法、紫外分光光度法、2,4-二硝基苯肼比色法、高效液相色譜法、熒光法以及電化學(xué)法等。這些方法都存在不同的局限性，如：2,4-二硝基苯肼比色法操作麻煩，耗時(shí)較長；碘滴定法和2,6-二氯靛酚法都易受到樣品提取液顏色的影響；含酸量較高樣品易造成紫外分光光度法測定的結(jié)果重復(fù)性較差等[6]。近年來，對(duì)羅漢果的開發(fā)與利用主要集中在將羅漢果中的甜苷開發(fā)成各種保健品、食品添加劑，而目前對(duì)于羅漢果中的VC綜合開發(fā)利用的不多，主要應(yīng)用于果飲業(yè)[7-8]。江新能等[9]報(bào)道采用碘酸鉀滴定法測定羅漢果中VC的含量，而采用高效液相色譜法對(duì)羅漢果中VC含量的分析目前尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)建立的羅漢果VC含量檢測的HPLC色譜法具有精密、快速、簡便等優(yōu)點(diǎn)，能夠應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)中的檢測，為開發(fā)羅漢果中豐富的VC，提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

成熟鮮羅漢果產(chǎn)自桂林桂北地區(qū)。

甲醇(色譜純) 美國Tedia公司；磷酸、酒石酸、草酸(均為分析純) 西隴化工廠；VC對(duì)照品(純度大于99.7%) 湖南省南化化學(xué)品有限公司；超純水為自制。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1100分析型高效液相色譜儀(包括二極管陣列多波長檢測器(DAD)、四元梯度泵、在線真空脫氣機(jī)、7725i手動(dòng)進(jìn)樣器、HP化學(xué)工作站) 美國Agilent公司；超純水儀 Millipore公司；pHtestr20防水型pH計(jì) 美國Eutech公司；多功能食品加工機(jī) 上海塞康電器有限公司；TDZ4A-WS低速臺(tái)式離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-BP(250mm×4.6mm，5μm)；柱溫25℃；檢測波長242nm；流速1.0mL/min；流動(dòng)相：體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2，V/V)；進(jìn)樣量10μL。

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取10.0g成熟鮮羅漢果，置于多功能食品加工機(jī)中，迅速加入100mL 5g/L草酸溶液(4℃)勻漿后浸提15min，減壓抽濾并用5g/L草酸溶液沖洗濾渣，濾液移至200mL的棕色容量瓶中，再用5g/L的草酸溶液定容，搖勻，取適量溶液經(jīng)0.45μm濾膜濾過，濾液作為供試溶液備用。

1.3.3 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取50.0mg VC對(duì)照品，置于50mL棕色容量瓶中，用體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液溶解并定容至刻度，搖勻，避光冷藏。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的選擇

本實(shí)驗(yàn)在借鑒文獻(xiàn)[10-12]的基礎(chǔ)上，根據(jù)具體情況對(duì)色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。利用DAD檢測器記錄對(duì)照品VC在190～400nm范圍內(nèi)的三維圖，確定VC在242nm的波長下有最大吸收。

以甲醇-磷酸二氫鉀(以磷酸調(diào)到pH2.40、2.60和2.80)和甲醇-磷酸溶液(體積分?jǐn)?shù)0.1%、0.05%和0.01%)作為流動(dòng)相進(jìn)行考察，結(jié)果表明：兩種流動(dòng)相均可以對(duì)羅漢果中的VC實(shí)現(xiàn)分離，但對(duì)其中一些峰的分離及保留時(shí)間產(chǎn)生影響。考慮到流動(dòng)相中酸的含量過高以及緩沖鹽都會(huì)對(duì)柱子和泵產(chǎn)生不良影響，所以選用體積分?jǐn)?shù)0.05%的磷酸溶液-甲醇作為流動(dòng)相。對(duì)于不同比例的甲醇不僅能改善峰形，還影響VC的出峰時(shí)間，考察體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(100:0、98:2、96:4、94:6、92:8，90:10，V/V)系統(tǒng)中不同比例的甲醇對(duì)VC分離情況的影響，結(jié)果表明：隨著甲醇比例增加，VC的保留時(shí)間不斷提前且造成其中一些峰重疊，但在體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇在98:2(V/V)配比下，分離度較好，VC色譜峰與前后兩個(gè)小峰達(dá)到基本分離(圖1)，因此選用體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液-甲醇(98:2，V/V)作為流動(dòng)相。

圖1 羅漢果VC分離色譜圖Fig.1 HPLC separation of VC in Siraitia grosvenorii fruits

2.2 樣品提取液的選擇

VC的穩(wěn)定性除了受到光、熱、氧、金屬離子以及溶液pH值影響之外，還受到細(xì)胞色素氧化酶、抗壞血酸氧化酶和過氧化物酶的影響[13]，因此在提取時(shí)盡量避光低溫以及選擇弱酸性的提取媒介。本實(shí)驗(yàn)在參考丁健樺等[14]和王翠琴等[15]對(duì)VC的穩(wěn)定性研究的基礎(chǔ)上，選擇體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸溶液、5g/L酒石酸溶液和5g/L草酸溶液作為提取液，按1.3.2節(jié)方法進(jìn)行操作，考察VC的提取率及其穩(wěn)定性，結(jié)果表明：3種提取液對(duì)VC的提取率大致一樣，磷酸溶液稍高，酒石酸溶液其次；但酒石酸溶液、磷酸溶液作為提取液的穩(wěn)定性較差，VC的含量隨著時(shí)間呈線性遞減，而5g/L的草酸溶液能夠在5h 內(nèi)保持VC的含量基本不變(圖2)。所以選用5g/L草酸作為提取液。

圖2 3種提取液對(duì)VC提取穩(wěn)定性的影響Fig.2 Screening for optimal solvent for sample extraction

2.3 浸提時(shí)間的考察

稱取10.0g的成熟鮮羅漢果，置于多功能食品加工機(jī)中，迅速加入200mL 5g/L草酸溶液(4℃)勻漿后，于0、5、10、15、20min取少量的提取液，4000r/min離心2min后取上清液過0.45μm濾膜，進(jìn)樣10μL，測定結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明：隨著浸提時(shí)間延長，提取液中的VC含量不斷增加，但增加的趨勢逐漸放緩，從15～20min VC的含量已無顯著變化，綜合考慮，確定浸提時(shí)間為15min。

圖3 不同浸提時(shí)間對(duì)VC含量的影響Fig.3 Screening for optimal operating duration for sample extraction

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系與檢出限

分別精密吸取對(duì)照品溶液2.0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL于25mL的容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)0.05%磷酸緩沖液溶解并定容至刻度，按1.3.1節(jié)色譜條件進(jìn)行分析，進(jìn)樣體積為10μL，以對(duì)照品的峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X，mg/mL)進(jìn)行線性回歸計(jì)算(表1)，回歸方程為：Y=31766X+153.62，r=1，質(zhì)量濃度在0.08～0.50mg/mL峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系。信噪比RSN=3，測得VC檢測限為1.0ng。

表1 線性關(guān)系Table 1 Preparation of VC standard curve

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn)

取同一質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，進(jìn)樣10μL測得VC峰面積的RSD為0.21%。表明該儀器精密度良好。

2.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)

按1.3.2節(jié)操作處理樣品5份，分別進(jìn)樣10μL，測定VC峰面積的RSD為1.45%，表明該方法的重現(xiàn)性較好。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

供試品溶液在制備后分別于0、2、4、8、12、24、48h進(jìn)樣10μL，測定VC峰面積的RSD為0.93%，羅漢果VC在48h內(nèi)損失率為2.44%，結(jié)果表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.5 回收率實(shí)驗(yàn)

由表2可知，VC的平均回收率為99.3%，RSD為1.93%，表明該方法具有較高的加標(biāo)回收率和精密度。

表2 外標(biāo)法測定VC回收率結(jié)果(n=5)Table 2 Average spike recovery test for the developed method (n=5)

2.5 不同產(chǎn)地的成熟鮮羅漢果VC的含量測定

按1.3.2節(jié)方法對(duì)不同產(chǎn)地的成熟鮮羅漢果進(jìn)行處理，分析測定，結(jié)果見表3。結(jié)果表明：不同產(chǎn)地的羅漢果中VC的含量存在一定差異。

表3 不同產(chǎn)地羅漢果中VC含量的測定Table 3 VC contents of Siraitia grosvenorii fruits from different growing areas determined by the developed method

3 結(jié) 論

3.1 本研究建立高效液相色譜法測定羅漢果中VC含量的方法，該方法操作簡便、精密度和穩(wěn)定性好，可以快速準(zhǔn)確地對(duì)羅漢果中VC進(jìn)行提取和定量分析；可以為羅漢果中VC的開發(fā)提供參考。

3.2 本實(shí)驗(yàn)采用草酸溶液作為提取液，能夠較好地對(duì)羅漢果中的VC起到保護(hù)作用，減少VC的降解。

[1] 中華人民共和國衛(wèi)生部藥典委員會(huì). 中華人民共和國藥典[M]. 北京:化學(xué)工業(yè)出版社, 2005: 184.

[2] 王勤, 李愛媛, 李獻(xiàn)萍. 羅漢果的藥理作用研究[J]. 中國中藥雜志,1999, 24(7): 425-428.

[3] 周欣欣, 宋俊生. 羅漢果及羅漢果提取物藥理作用的研究[J]. 中醫(yī)藥學(xué)刊, 2004, 23(9): 1723-1724.

[4] 王勤. 羅漢果化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 中藥材, 2001, 24(3):215-217.

[5] 徐位坤, 孟麗珊. 羅漢果中維生素C含量的測定[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),1980(1): 36-37.

[6] 林桂榮, 郭泳, 付亞文, 等. 新鮮果蔬維生素C測定方法研究[J]. 北方園藝, 1995(2): 7-9.

[7] 宋云飛, 季永賢, 梁遠(yuǎn)盛, 等. 一種羅漢果果汁制備方法: 中國,200510066542.X[P]. 2005-09-07.

[8] 張立華. 制取鮮羅漢果濃縮汁的方法: 中國, 200310107507.9[P]. 2003-12-12.

[9] 江新能, 李峰, 蔣漢明. 羅漢果果實(shí)生長發(fā)育與內(nèi)含物變化的研究[J]. 廣西植物, 1999, 10(3): 223-227.

[10] 馮德明, 周曉霞. 用高效液色譜(HPLC)法測定飲料中維生素C的含量[J]. 飲料工業(yè), 2003, 6(1): 43-46.

[11] 張旭, 吳衛(wèi), 鄭有良, 等. 紫蘇屬植物葉中維生素的HPCL測定[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2008, 36(19): 8131-8133.

[12] 劉勝輝, 臧小平. 高效液相色譜法測定水果中的抗壞血酸[J]. 生命科學(xué)儀器, 2005, 3(4): 38-40.

[13] 梁華俤, 潘林娜, 魏勤. 獼猴桃果實(shí)采后VC變化規(guī)律及其穩(wěn)定性[J].食品科學(xué), 1993, 14(5): 3-9.

[14] 丁健樺, 饒火瑜, 王興祥. HPLC法初步研究維生素C的穩(wěn)定性[J].食品工業(yè), 2004,(1): 44-45.

[15] 王翠琴, 仲飛, 崔彥鵬, 等. 熱處理對(duì)果汁維生素C穩(wěn)定性因素影響的研究[J]. 河北農(nóng)業(yè)技術(shù)師范學(xué)院學(xué)報(bào), 1993, 7(4): 36-42.

Determination of the Content of Vitamin C inSiraitia grosvenoriiFruits by HPLC

NING De-sheng，LIANG Xiao-yan，F(xiàn)ANG Hong
(Guangxi Institute of Botany, Guangxi Zhuangzu Autonomous Region and China Academy of Sciences, Guilin 541006, China)

Objective: To set up a HPLC method for the determination of the content of vitamin C in the fruits ofSiraitia grosvenorii. Methods: The chromatographic separation was achieved on SinoChrom ODS-BP (250 mm×4.6 mm, 5μm) held at 25 ℃ using a mixture composed of 0.05% H3PO4 and CH3OH (98:2,V/V) as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min.The diode array detector wavelength was set at 242 nm. The injection volume used was 10μL. Results: The developed calibration curve of vitamin C displayed good linearity over the concentration range from 0.08 to 5.0 mg/mL, with a correlation coefficient equaling 1. The average recovery of five replicates for vitamin C was 99.3% with 1.93% relative standard deviation (RSD).Conclusion: This method is simple, quick, precise and stable, and can used for determining the content of vitamin C in the fruits ofSiraitia grosvenorii.

Siraitia grosvenorii；HPLC；VC

Q946.6

A

1002-6630(2010)20-0311-03

2010-01-03

寧德生(1982—)，男，研究實(shí)習(xí)員，學(xué)士，主要從事植物化學(xué)與藥學(xué)研究。E-mail：ndshgxib@sina.com