張小芳，趙健雄

（1.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 蘭州 730050）

葡萄籽原花青素對肺癌放射增敏作用的實驗研究

張小芳1，趙健雄2

（1.蘭州市第一人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050；2.蘭州大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究所，甘肅 蘭州 730050）

目的 研究葡萄籽原花青素提取物對肺癌SPC-A-1細胞X射線放療的增敏作用。方法 應(yīng)用MTT法和集落形成法研究葡萄籽原花青素放療增敏效應(yīng)，單因素方差分析確定增敏劑量和增敏作用，單擊多靶模型曲線擬合計算增敏比及相關(guān)參數(shù)。結(jié)果 MTT法檢測結(jié)果表明，單獨應(yīng)用葡萄籽原花青素對SPC-A-1細胞抑制作用較弱；細胞藥物處理后對X射線的敏感性增強，單因素方差分析表明藥物和X射線有協(xié)同作用（P＜0.05），藥物劑量為100μg/ml時表現(xiàn)出增敏效應(yīng)。集落形成法結(jié)果表明，藥物劑量為100μg/ml對X射線增敏作用明顯，增敏比為2.56。結(jié)論 葡萄籽原花青素對肺癌SPC-A-1細胞有顯著的放療增敏作用。

葡萄籽原花青素；肺癌SPC-A-1細胞；實驗研究

原花青素（PC）是由不同數(shù)量的兒茶素或表兒茶素縮合而成的一大類酚類化合物，廣泛分布于植物界，許多食品和飲料中都含有豐富的原花青素。1970年，原花青素首次從葡萄籽中提取成功。原花青素有非常強大的抗氧化和清除自由基的能力。據(jù)報道，其在體內(nèi)抗氧化能力是VE的50倍、VC的20倍；具有多種藥理作用，如抗炎、抗腫瘤、保護心血管系統(tǒng)、抗衰老等[1]。其中葡萄籽原花青素提取物（GSPE）為最早提取成功的原花青素，對其研究也最為廣泛，由于其安全（口服急性毒性LD50＞5 000 mg/kg，急性皮膚毒性2 000 mg/kg)、高效和高生物利用率等，使原花青素在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[2]。

據(jù)報道，原花青素對皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等都有一定的預(yù)防或治療作用，但單獨應(yīng)用療效并不理想。基于此，我們研究了GSPE對于肺癌的放療增敏作用，為擴大GSPE的臨床應(yīng)用和肺癌的放射增敏治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

GSPE：天津市尖峰天然產(chǎn)物研究開發(fā)有限公司產(chǎn)品；小牛血清:杭州四季青公司產(chǎn)品；RMPI-1640培養(yǎng)基干粉:GIBCO公司產(chǎn)品；噻唑藍（MTT）:SIGMA公司產(chǎn)品。

1.2 儀器

倒置相差顯微鏡:OLYMPUS IX70,OLYMPUS公司產(chǎn)品;BIO-RAD iMark自動酶標(biāo)儀（日本）。1.3方法

1.3.1 MTT法檢測GSPE對X射線增敏作用 取對數(shù)生長期細胞，0.25%胰酶消化，吹打均勻，計數(shù)，稀釋至5×104個/毫升，細胞懸液以每孔90 μl接種至96孔板，培養(yǎng)貼壁24h后加藥處理。實驗設(shè)陰性對照組、空白對照組、原花青素各劑量組、原花青素各劑量顏色對照組，每孔90 μl加藥，每個濃度設(shè)3個復(fù)孔。陰性對照組和空白對照組加pH 6.8的磷酸鹽緩沖液，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h后進行X射線照射。

照射參數(shù)：6MeV直線加速器下，在2.5Gy/min時以不同劑量X射線照射，源皮距為100cm。照射結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)4d，取出每孔中加入MTT 10μl（5mg/ml），再培養(yǎng)4h后，吸去培養(yǎng)液，加入二甲基亞砜（DMSO）150μl，震蕩 10min，酶標(biāo)儀單波長 490nm測定每孔吸光度值 (OD)。按下列公式計算抑制率（IR

1.3.2 集落形成法檢測GSPE對X射線照射后細胞增殖的抑制作用 取對數(shù)生長期的各組細胞，0.25%胰酶消化制備細胞懸液。60mm培養(yǎng)皿中分別按藥物劑量不同種入不同數(shù)量的細胞。細胞貼壁后，分別給予不同劑量藥物（0、25、100、200μg/ml）作用24h，再給予0、1、5、9Gy劑量X射線照射，每組3個復(fù)孔。照射后置37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8～10d。取出后倒去培養(yǎng)液，PBS漂洗2次，用醋酸甲醇固定，姬姆薩染色10min,在解剖鏡下計數(shù)直徑大于50mm（或含50個細胞以上）的細胞克隆。按以下公式計算存活分?jǐn)?shù)：存活率=（某劑量的集落形成數(shù)/某劑量下種植的細胞數(shù)）×100%

1.4 統(tǒng)計方法

MTT法各組吸光度值差異采用單因素方差分析，SPSS 13.0統(tǒng)計軟件錄入數(shù)據(jù)。集落形成存活率分析采用單擊多靶模型曲線擬合，Graphpad Prism 5.0軟件錄入數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測GSPE增敏殺傷作用

檢測不同藥物濃度在不同劑量X射線照射下的增敏作用，抑制率結(jié)果見表1。對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，結(jié)果表明，X射線和GSPE均可顯著影響腫瘤細胞的存活率，并且二者之間存在協(xié)同關(guān)系，有顯著性差異（P＜0.01），但對細胞殺傷的作用不同。為進一步分析二者之間的相關(guān)性，固定其中一個因素水平即藥物劑量，研究各劑量藥物的增敏作用。結(jié)果表明，在藥物劑量小于25μg/ml時，藥物對腫瘤細胞沒有殺傷作用，藥物劑量也無增敏作用；藥物劑量為50μg/ml時，藥物對腫瘤細胞無殺傷作用，但有增敏作用；藥物劑量為100μg/ml時，藥物對腫瘤細胞有殺傷作用，同時也有增敏作用；藥物劑量大于200μg/ml時，藥物對腫瘤細胞的殺傷作用強于X射線，表現(xiàn)為協(xié)同作用。所以藥物劑量50～100μg/ml可以認為是GSPE的有效增敏濃度。

2.2 集落形成法研究藥物和X射線對肺癌細胞的增殖抑制作用腫瘤細胞具有無限增殖的潛力，但以藥物干預(yù)或X射線照射后會使部分未立即死亡細胞在繼續(xù)分裂數(shù)代后停止增殖。集落形成法觀察細胞的增殖抑制作用結(jié)果見表2。以“多靶單擊模型”進行曲線擬合，“多靶單擊模型”方程：SF=1-（1-e-D/D0）N,Dq=D0lnN，其中SF為存活分?jǐn)?shù)，D為放射劑量（Gy），D0代表平均致死量，Dq代表準(zhǔn)域劑量，N為外推數(shù)，結(jié)果見表3。

3 討論

表1 MTT法檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞的抑制率（±s）

表1 MTT法檢測GSPE合用X射線對SPC-A-1細胞的抑制率（±s）

藥物劑量（μg/ml）X射線劑量（Gy）0 1 3 5 7 9 12.5 25 50 100 200 400 800 0.00±0.35 4.51±0.05 7.57±1.22 24.31±7.53 44.58±2.27 51.57±0.51 55.18±1.24 0.00±2.46 3.32±4.69 14.10±1.26 37.37±2.71 44.68±1.61 54.75±1.77 57.93±2.33 0.00±2.07 2.29±3.80 10.66±2.32 40.48±2.35 53.46±1.73 67.50±1.33 68.42±0.18 0.00±3.44 5.46±1.09 13.76±9.98 35.35±6.02 58.04±1.25 68.41±1.31 71.25±0.03 4.50± 6.22 11.36± 0.79 21.82±11.30 45.09± 3.91 77.47± 0.14 86.29± 2.73 87.90± 1.07 17.36±0.26 25.06±0.05 41.38±1.05 56.55±2.20 75.50±0.31 83.01±0.16 83.05±0.63

表2 集落形成法測定藥物和X射線對肺癌細胞的抑制率

表3 100μg/mlGSPE劑量增敏曲線分析

惡性腫瘤是危害人類生命和健康的一種嚴(yán)重疾病，其防治已成為世界性的保健與醫(yī)學(xué)問題。其中癌癥的放射治療方法越來越受到人們的重視，同時放射治療也是肺癌的主要治療手段。但放射治療不可避免地存在放射抗拒，也是影響放療治療劑量的主要因素之一。20世紀(jì)60年代初，開展了對放射增敏劑的研究，能夠?qū)Ψρ跫毎刑囟ǖ募毎拘宰饔?，而對有氧的正常組織無毒性，我國自主研發(fā)的新藥甘氨雙唑鈉對鼻咽癌、食管癌均有較好療效，安全性較高，但部分Ⅱ期臨床試驗結(jié)果并不令人滿意，抑制腫瘤的總有效率與單用放療無顯著性差異，同時能否降低放射劑量值得商榷。因此，減輕和預(yù)防放射性肺損傷的發(fā)生，對提高患者的生活質(zhì)量和預(yù)后具有重要意義。近年來的研究顯示，原花青素不僅可抑制皮膚癌、口腔癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤細胞的生長，誘導(dǎo)多種腫瘤細胞凋亡[3]，而且可以拮抗化療藥物對正常細胞的毒性作用[4]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，原花青素對肺癌有治療作用，對肺癌細胞和大鼠多臟器癌癥模型的肺癌均有較好的治療和預(yù)防作用，因此，本實驗設(shè)計研究GSPE的放療增敏作用。實驗結(jié)果表明，GSPE對肺癌SPC-A-1細胞有較好的放療增敏作用，增敏劑量在50～100μg/ml之間，低于該劑量增敏效果不顯著。在增敏劑量下對單獨X射線照射和藥物作用后X射線照射細胞存活分?jǐn)?shù)進行曲線擬合，結(jié)果表明，GSPE對X射線有顯著的增敏作用，藥物作用后D0值降低，表明細胞對X射線敏感性增加；Dq代表準(zhǔn)域劑量，它反映肩區(qū)的大小，表明細胞亞致死損傷修復(fù)能力。藥物作用后，Dq變小，說明細胞修復(fù)亞致死損傷的能力變?nèi)?；N值減小則細胞在低劑量區(qū)時對亞致死損傷的耐受性降低，增敏比為2.56。本實驗為GSPE改善肺癌放療抵抗的臨床應(yīng)用提供了依據(jù)。但是GSPE對肺癌SPC-A-1細胞的增敏機理尚不明確，有待進一步研究。

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R979.1

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1671-1246（2010）05-0091-02