莊 平, 丁建文, 侯俊利, 章龍珍, 劉鑒毅, 劉 健, 張 濤,田美平

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)重點開放實驗室, 上海 200090; 2. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院, 上海 200237; 3. 上海市長江口中華鱘自然保護區(qū)管理處, 上海 200002)

中華鱘卵黃脂磷蛋白的分離純化及性質(zhì)分析

莊 平1,2, 丁建文1,2, 侯俊利1, 章龍珍1, 劉鑒毅1, 劉 健3, 張 濤1,田美平1

(1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 東海水產(chǎn)研究所 農(nóng)業(yè)部海洋與河口漁業(yè)重點開放實驗室, 上海 200090; 2. 華東理工大學(xué) 生物工程學(xué)院, 上海 200237; 3. 上海市長江口中華鱘自然保護區(qū)管理處, 上海 200002)

采用 Sephacryl S-300凝膠過濾和 DEAE Fast Flow陰離子交換兩種層析法分離純化中華鱘(Acipenser sinensis)卵黃脂磷蛋白(lipovitellin, Lv), 對每個峰進行SDS-PAGE電泳及油紅O、甲基綠和Schiff試劑特異染色, 峰Ⅱ蛋白均呈陽性, 表明峰Ⅱ蛋白為中華鱘卵中的一種卵黃脂磷蛋白,SDS-PAGE電泳分析表明其由一種分子質(zhì)量為43.5 ku的亞基構(gòu)成。對中華鱘Lv氨基酸組成進行研究,證明其是一種含有相對較多天冬氨酸、谷氨酸、纈氨酸和亮氨酸的蛋白。

中華鱘(Acipenser sinensis ); 卵黃脂磷蛋白; 凝膠過濾層析; 離子交換層析

中華鱘(Acipenser sinensis)為大型溯河洄游性魚類, 軟骨硬鱗類鱘形目[1]。主要分布在我國東海、黃海, 在長江產(chǎn)卵繁殖, 是長江特有的 3種鱘魚之一,也是目前地球上最古老最原始的輻鰭魚類之一, 被譽為“活化石”[2]。近來因環(huán)境污染和水利工程阻斷其徊游通道等原因, 其生態(tài)環(huán)境遭到嚴(yán)重的破壞,數(shù)量銳減, 被列為國家一級重點保護動物[3]。

卵黃是魚類胚胎發(fā)生期的主要營養(yǎng)物質(zhì), 卵黃的數(shù)量和質(zhì)量對于早期幼體維持生命和生長發(fā)育至關(guān)重要[4]。卵黃積累過程是魚類性腺發(fā)育中的重要過程。鱘魚類在孵出后的6～7d內(nèi), 其幼體完全依賴卵黃來滿足營養(yǎng)的需要, 而無需攝取外源性營養(yǎng)[5]。卵黃的組成十分復(fù)雜, 包括蛋白質(zhì)、脂類、碳水化合物、游離脂肪酸、核苷酸和核酸等物質(zhì), 其中卵黃蛋白(vitellin)是卵黃中的主要組成物質(zhì)[6]。目前, 對于關(guān)于鱘魚卵黃蛋白的研究, 只有小體鱘[7]、雜交鱘[5]和施氏鱘[8]中有過報道。對中華鱘卵黃蛋白的研究尚未見報道。本研究分離純化了中華鱘卵黃脂磷蛋白, 并對其部分理化性質(zhì)及氨基酸組成等方面進行了研究,為進一步了解鱘科魚類的卵黃發(fā)生、調(diào)控機理和中華鱘初始生長發(fā)育機制提供一些理論基礎(chǔ), 對中華鱘的保護和繁殖具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗動物

2007年6月15日浙江寧波石浦鎮(zhèn), 東經(jīng)123°35′,北緯 31°31′處拖網(wǎng)誤捕野生成熟雌性中華鱘(長約3.18 m, 質(zhì)量 215 kg), 受傷死亡后解剖收集中華鱘魚卵并去除其內(nèi)附脂肪, 用緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0)沖洗干凈, 于-80℃超低溫冰箱中保存待用。

1.1.2 主要試劑

低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白購自大連寶生物工程有限公司, 成分為兔磷酸化酶 B 97.4 ku, 牛血清白蛋白66.2 ku, 兔肌動蛋白43.0 ku, 牛碳酸酐31.0 ku, 胰蛋白酶抑制劑 20.1 ku; Sephacryl S-300購自 GE Healthcare公司; 疊氮鈉和苯甲基磺酰氟購自上海捷瑞生物工程有限公司; 甲基綠、堿性品紅和油紅 O為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。其他試劑為進口分裝或國產(chǎn)。

1.2 實驗方法

1.2.1 中華鱘全卵粗提液的制備

取中華鱘魚卵50 g, 加入2倍體積預(yù)冷的勻漿緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl 含 0.1 mol/L NaCl、0.01%的疊氮鈉、0.1 mmol/L苯甲基磺酰氟, pH 8.0)。用玻璃勻漿器在冰浴條件下初步研碎后, 4℃條件下超聲波細胞粉碎機破碎(寧波新芝超聲波細胞破碎儀, 工作15次, 每次持續(xù)時間3 s)。勻漿液在4℃條件下經(jīng)12 000g離心15 min, 取中間層清液用0.45 μm微孔濾膜過濾后用于層析分離。

1.2.2 凝膠過濾層析

取卵蛋白粗提取液上柱, 選取丙烯葡聚糖凝膠Sephacryl S-300作為填料, 柱子規(guī)格為(1.6 cm×70 cm), 用 20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.0, 含 0.1 mol/L NaCl)勻速洗脫, 洗脫流速0.8 mL/min。采用上海精科公司 HD-9704型核酸蛋白檢測儀在線檢測(波長定于280 nm), 電腦自動記錄洗脫曲線。自動分部收集器以每管2 mL收集各洗脫峰, 洗脫完畢合并主峰。

1.2.3 離子交換層析

將樣品上柱, 選取陰離子交換樹脂 DEAESepharose Fast Flow作為填料自行裝柱(1.6 cm×20 cm), 用分別含有 0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 mol/L NaCl的Tris-HCl緩沖液(20 mmol/L, pH 8.0), 以2 mL/min流速進行分部洗脫, 280 nm處蛋白紫外檢測儀在線檢測。自動分部收集器以每管 3 mL收集各洗脫峰,洗脫完畢合并主峰。將可能的卵黃脂磷蛋白樣品放入透析袋中脫鹽24 h, 然后采用EYELA FDU-1100型冷凍干燥機對收集液進行濃縮(-45℃, 10 Pa)。

1.2.4 變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

將濃縮的各洗脫峰分別進行變性聚丙烯酰胺電泳。分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%, 濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,樣品與上樣緩沖液以4：1混合, 濃縮電壓100 V, 分離電壓恒定為180 V。待指示劑距分離膠末端0.5 cm處停止電泳。電泳后的凝膠用固定液(甲醇：冰醋酸：蒸餾水=5：1：4)浸泡 2 h, 然后于 0.1%考馬斯亮藍R-250染色 2 h, 再在脫色液(甲醇：冰醋酸：蒸餾水=1：1：8)中脫色至背景清晰[9]。用 BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)拍照保存。所分離的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量采用BIO-RAD凝膠圖像分析軟件 Quantity One Version 4.5.2完成。

1.2.5 脂蛋白特性鑒定

參照 Noble等[10]的方法。將電泳后的凝膠放入5%乙酸中固定 20 min, 用水沖洗數(shù)次后, 放入油紅O染液中過夜, 第二天將凝膠在 60%酒精中浸洗 5 min, 最后用蒸餾水沖洗以除去底色, 用佳能數(shù)碼相機拍照保存。

1.2.6 磷蛋白特性檢測

參照 Cutting等[11]的方法。將電泳后的凝膠轉(zhuǎn)入10%磺基水楊酸中固定1 h, 在60℃條件下, 經(jīng)0.5 mol/L NaOH溶液浸浴30 min后, 用1%鉬酸銨洗滌10 min, 然后再采用1 mol/L HNO3配置的1%鉬酸銨溶液染色30 min。最后用0.5%甲基綠染色液染色30 min,經(jīng)10%磺基水楊酸脫色至磷蛋白條帶清晰為止。

1.2.7 糖蛋白特性檢測

參照 Fairbanks[12]和 Sun等[13]的方法。將電泳后的凝膠放入 15%的三氯乙酸中, 4℃下振蕩過夜;然后將凝膠放入0.5%的高碘酸中振蕩2 h。隨后將凝膠移入20 mmol/L的高碘酸鈉溶液中, 30 min后用5 mmol/L高碘酸鈉溶液洗滌2次, 每次20 min。再用5%的乙酸洗滌 10 min, 將洗滌后的凝膠放入 Schiff試劑中染色過夜。最后用5 mmol/L的Na2S2O5(內(nèi)含10 mmol/L HCl)溶液對凝膠進行漂洗, 至背景不再顯示粉紅色。

1.2.8 氨基酸組成分析

取適量卵黃磷脂蛋白樣品于6 mol/L HCl中消化24 h, 充氮氣, 封管; 在110℃條件下水解24 h。開管,樣品抽真空干燥, 去離子水洗。水解后氨基酸樣品用緩沖液稀釋后上機, 用Biochrom 20型氨基酸自動分析儀分析測定其氨基酸組分及含量。

2 結(jié) 果

2.1 卵粗提液SDS-PAGE電泳

中華鱘全卵粗提液經(jīng) 12%SDS-PAGE電泳后共得6條帶(圖1), 分子質(zhì)量分別是64.3、43.5、37.4、26.1、17.4和15.6 ku, 其中分子質(zhì)量為43.5 ku的蛋白電泳為主帶型。

圖1 中華鱘卵粗提液SDS-PAGE電泳圖譜Fig. 1 SDS-PAGE of the crude egg extract of Acipenser sinensisM： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白; A、B： 中華鱘卵粗提液M： Protein markers; A, B： Crude egg extract

2.2 卵黃蛋白的分離純化

卵粗提液經(jīng)Sephacryl S-300凝膠過濾層析的洗脫曲線如圖2所示, 共得到A、B、C和D 4個洗脫峰。各峰之間分離效果良好, 經(jīng) SDS-PAGE電泳后發(fā)現(xiàn)峰 B有明顯大分子主帶出現(xiàn)。由于魚卵中主要蛋白均為大分子質(zhì)量的Lv, 從而初步推測峰B中可能含有Lv, 將峰B進一步經(jīng)DEAE離子交換層析分離, 采取梯度洗脫如(圖 3), 對各峰脫鹽濃縮后做進一步特異染色鑒定, 確定峰Ⅱ即為中華鱘Lv。

圖2 中華鱘卵粗提液Sephacryl S-300洗脫曲線Fig. 2 Separation of the crude egg extract of Acipenser sinensis by gel filtration chromatography on a Sephacryl S-300 column

圖3 峰B蛋白DEAE離子交換層析洗脫曲線Fig. 3 Further separation of fraction B by a DEAE column

2.3 峰Ⅱ蛋白SDS-PAGE電泳分析

卵粗提液經(jīng)凝膠過濾層析初步分離得到的峰B進行SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖4, 將峰B作進一步離子交換層析后純化所得的峰Ⅱ進行SDS-PAGE電泳分析(圖5), 結(jié)果顯示為單一條帶, 表明中華鱘Lv是由一種表觀分子質(zhì)量為43.5 ku的亞基構(gòu)成。

2.4 糖、脂、磷蛋白特異染色

純化所得的中華鱘Lv經(jīng)Schiff、油紅O和甲基綠-鉬氨酸特異染色(圖 6), 峰Ⅱ蛋白均呈現(xiàn)陽性反應(yīng), 磷蛋白、脂蛋白和糖蛋白均在蛋白圖譜的同一位置出現(xiàn)相同的帶, 表明純化所得峰Ⅱ蛋白確是一種卵黃脂磷蛋白。

圖4 峰B蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 4 SDS-PAGE of proteins in fraction Ba、b： 峰 B 蛋白; M： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白a, b： Proteins in fraction B; M： Protein markers

圖5 峰Ⅱ蛋白SDS-PAGE圖譜Fig. 5 SDS-PAGE of fraction Ⅱ1、2： 峰Ⅱ蛋白; M： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白1, 2： Protein in peak II; M： Protein markers

圖6 峰Ⅱ蛋白特異染色Fig. 6 Specific stains of protein in fraction ⅡR1. 糖蛋白特異染色; R2. 脂蛋白特異染色; R3. 磷蛋白特異染色R1. Glycosidoprotein stain; R2. Lipoprotein stain; R3. Phosphoprotein stain

2.5 Lv氨基酸組成分析

將中華鱘 Lv的氨基酸組成與西伯利亞鱘(A.baerii)[14]、哲羅魚(Hucho taimen)[15]和虹鱒(Oncorhynchus mykiss)[16]的比較結(jié)果見表1。結(jié)果顯示, 中華鱘 Lv中必須氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(57.19%)高于非必須氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)(42.81%)。其中天冬氨酸(11.28%)、谷氨酸(10.29%)、亮氨酸(9.31%)和纈氨酸(8.56%)含量較高, 占氨基酸總質(zhì)量的39.44%。含量最少的是半胱氨酸, 為蛋白含量的0.71%, 其次含量較少的是甲硫氨酸, 約占總量的0.85%。

表1 中華鱘卵黃脂磷蛋白的氨基酸組成與其他魚的比較(質(zhì)量分?jǐn)?shù), %)Tab. 1 Amino acid composition of Lv purified from Acipenser sinensis (weight %)

3 討 論

Lv是魚類卵黃中的主要組成物質(zhì), 分子質(zhì)量從30 ku到120 ku不等[17]。卵黃形成主要有兩種方式：一是可以在卵母細胞本身中合成, 稱為內(nèi)源卵黃合成; 二是在卵母細胞以外的地方合成, 然后入卵母細胞, 稱為外源性卵黃合成。在卵黃形成期, 魚類在雌激素作用之下, 由肝臟合成卵黃蛋白原(vitellogenin, Vtg)后, 分泌到血液中, 由血液運送到卵巢, 在成熟的卵母細胞中裂解成 2個主要的卵黃蛋白成分： Lv和卵黃高磷蛋白(Phosvitin, Pv), 還有一些小的蛋白和多肽[18]。

目前普遍用于分離純化Lv的方法很多, 主要有EDTA加 MgCl2分級沉淀、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析和電泳法等[19]。現(xiàn)在已有若干魚類的 Lv被純化鑒定。張年國等[8]對施氏鱘的 Lv研究表明, 其是由一種分子質(zhì)量為30 ku的亞基構(gòu)成。日本鰻鱺(Anguilla japonica)的一種Lv是由4個分子質(zhì)量為85 ku的亞基構(gòu)成[20]。Fenske等[21]對斑馬魚(Danio rerio)的Lv研究表明, 其是由2種分子質(zhì)量分別為90 ku和86 ku的肽鏈構(gòu)成。姚靜等[22]對唐魚(Tanichthys albonubes)的研究也表明, 其 Lv是由分子質(zhì)量分別為98、96和71 ku的3種亞基構(gòu)成。

本實驗中華鱘的卵粗提液經(jīng) SDS-PAGE電泳,發(fā)現(xiàn)其由 6個不同種亞基組成, 亞基分子量分別為64.3、43.5、37.4、26.1、17.4和 15.6 ku, 這表明 Vtg進入卵母細胞后, 被蛋白酶水解成若干小分子的蛋白。在不同的物種或同屬不同種之間, 因為胚胎發(fā)育存在差異, 其所需的營養(yǎng)成分及其含量各不一樣,在卵巢的卵母細胞發(fā)育過程中卵黃蛋白原經(jīng)過不同形式的加工形成了卵黃蛋白的多樣性[17]。

通過選擇采用凝膠過濾與離子交換兩步層析法結(jié)合使用來分離純化中華鱘卵中的Lv, 在4℃和0.2 mmol/L蛋白酶抑制劑PMSF的條件下, 各峰之間分離效果明顯, 電泳分析表明, 很好地達到了純化中華鱘Lv的目的。經(jīng)SDS-PAGE電泳分析表明其是由一種表觀分子質(zhì)量為43.5 ku的亞基構(gòu)成。對分離純化得到的中華鱘Lv進行糖、磷、脂特異性染色, 結(jié)果均為陽性, 進一步證實了中華鱘Lv是一種糖脂磷蛋白, 這與西伯利亞鱘、施氏鱘和雜交鱘等[7,8,14]魚類的Lv含豐富的糖、脂和磷的特點一致。

對中華鱘Lv中的氨基酸組成進行了分析, 證明中華鱘Lv是一種含有相對較多天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和纈氨酸的蛋白, 占到了氨基酸總質(zhì)量的39.44%。這與西伯利亞鱘(A.baerii )[14]Lv中, 天冬氨酸、谷氨酸、亮氨酸和纈氨酸占氨基酸總質(zhì)量的(37.29%)十分類似。通過對這兩種鱘魚和其他魚種Lv中氨基酸組成進行分析發(fā)現(xiàn), 親緣關(guān)系較近的中華鱘與西伯利亞鱘Lv中其氨基酸組成及含量十分相似, 而與親緣關(guān)系較遠的哲羅魚[15]和虹鱒[16]的 Lv差別較大。其中中華鱘Lv中天冬氨酸含量顯著高于哲羅魚與虹鱒, 而丙氨酸含量相比則明顯偏少。另外發(fā)現(xiàn)中華鱘Lv與已研究過的虹鱒魚Lv中都有半胱氨酸被檢出, 可能主要與 Lv中二硫鍵的形成有關(guān),進而也證實了 Lv是由多個亞基構(gòu)成的一種復(fù)雜蛋白。這種復(fù)雜蛋白的發(fā)生和合成機制還有待于進一步研究。

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Purification and partial characterization of lipovitellin from Acipenser sinensis

ZHUANG Ping1,2, DING Jian-wen1,2, HOU Jun-li1, ZHANG Long-zhen1, LIU Jian-yi1, LIU Jian3, ZHANG Tao1, Tian Mei-ping1
(1. East Fishery Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shanghai 200090, China; 2. East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China; 3. Superintendence Department of Shanghai Yangtze Estuarine Natural Reserve for Chinese Sturgeon, Shanghai 200002, China )

Jul., 23, 2009

Acipenser sinensis; lipovitellin; Gel filtration chromatography; Anion exchange chromatography

Lipovitellin was purified from Acipenser sinensis using Sephacryls-300 gel filtration chromatography and DEAE anion exchange chromatography. The purified protein in fraction Ⅱwas a monomer of approximate 43.5 ku on SDS-PAGE. Oil red O, methyl green, and the Schiff staining reagents indicated that this protein was a lipo-phospho-glycoprotein. Amino acid analysis showed that lipovitellin of A. sinensis had relatively high contents of asparagines acid, glutamic acid, leucine acid, and valine acid.

S917

A

1000-3096(2010)06-0016-06

2009-07-23;

2009-11-25

國家自然基金項目(30490234); 上海市教委 E-研究院建設(shè)項目(E03009); 長江口中華鱘自然保護區(qū)專項; 中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項 (2007M01, 2007M023)

莊平(1960-), 男, 湖南桃源人, 研究員, 博士, 主要從事水生動物生理生態(tài)學(xué)和保護生物學(xué)研究, E-mail： pzhuang@online.sh.cn

(本文編輯： 康亦兼)