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        蚓激酶對(duì)鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

        2010-10-20 05:08:20山西省長(zhǎng)治鋼鐵集團(tuán)公司職工總醫(yī)院046031李青蘭李玲亢春生
        首都食品與醫(yī)藥 2010年20期
        關(guān)鍵詞:血漿模型

        山西省長(zhǎng)治鋼鐵集團(tuán)公司職工總醫(yī)院 (046031) 李青蘭 李玲 亢春生

        山西省長(zhǎng)治醫(yī)學(xué)院 (046000) 來利娜

        蚓激酶是從特種蚯蚓中提取的一組蛋白水解酶,是一種多酶制劑,具有降低纖維蛋白原含量,降低血小板聚集率,增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性,改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,常用于缺血性腦卒中、心肌梗死等血栓性疾病的治療和康復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過線栓動(dòng)脈法制備大鼠腦局灶缺血再灌注模型,觀察蚓激酶對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用,通過檢測(cè)血漿中PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α和 TXA2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2水平,探討其作用機(jī)制,為臨床用藥提供一定的科學(xué)依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康Wistar大鼠,體重220±20g,雌雄兼用(由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。

        1.2 藥品及試劑 蚓激酶(北京百奧藥業(yè)有限責(zé)任公司,國藥準(zhǔn)字H110211129)。復(fù)方丹參注射液(黃山市天目藥業(yè)有限公司,批號(hào):050601)。TXB2、6-Keto-PGF1α放免測(cè)定試劑盒(北京東亞免疫技術(shù)研究所,批號(hào):060113)。

        1.3 方法

        1.3.1 分組 大鼠隨機(jī)分為蚓激酶組、復(fù)方丹參注射液組、模型組、假手術(shù)組。其中,蚓激酶組灌胃(60萬單位,tid,連續(xù)5天);復(fù)方丹參組預(yù)先連續(xù)尾靜脈注射給藥,100mg/kg每天1次,連續(xù)5d,再灌注6h、12h時(shí)給藥2次;模型組和假手術(shù)組大鼠注射生理鹽水,給藥時(shí)間及體表面積同前。

        1.3.2 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立 以10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔麻醉,參照Longa等[1]的方法并加以改進(jìn),制備左側(cè)大腦中動(dòng)脈阻塞(MCAO)模型。頸正中做約1.5cm皮膚切口,暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)及頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA),結(jié)扎ECA,將頭端用石蠟包被的尼龍魚線通過CCA切口處插入ICA,插線長(zhǎng)度自CCA分叉處約18mm~20mm(據(jù)動(dòng)物體重而定),阻斷左側(cè)大腦中動(dòng)脈血流,然后縫合皮膚,栓線尾端部分固定于皮膚上。于缺血2h后,抽出尼龍魚線予以再灌注24h。假手術(shù)組中,大鼠只分離出CCA、ECA和ICA,不結(jié)扎任何動(dòng)脈及插線。

        1.3.3 神經(jīng)行為缺陷評(píng)分 大鼠在腦缺血2h再灌注24h后對(duì)動(dòng)物進(jìn)行行為評(píng)分。0分:無神經(jīng)功能缺失癥狀;1分:提大鼠尾,見癱瘓側(cè)前肢回收屈曲不能正常伸向地面;2分:推癱瘓側(cè)時(shí)感阻力較對(duì)側(cè)明顯降低;3分:大鼠爬行時(shí)向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn);4分:伴有意識(shí)障礙。分?jǐn)?shù)越高,則動(dòng)物的行為障礙越嚴(yán)重。

        1.3.4 腦梗塞范圍測(cè)定 在缺血2h再灌注24h后,每組取8只動(dòng)物,斷頭取腦,剔除嗅腦、低位腦干及小腦,稱重后置于-20℃低溫冰箱快速冷凍30min后,將腦組織做冠狀切片,厚度約為2mm。腦片置于1%TTC溶液中,37℃避光孵育30min。經(jīng)染色后,正常腦組織呈玫瑰紅色,而腦梗塞區(qū)呈蒼白色,待顯色完全后置50%甲醛溶液中固定24小時(shí)。仔細(xì)分離蒼白區(qū)和非蒼白區(qū),分別稱重,計(jì)算梗塞范圍。

        1.3.5 腦組織含水量測(cè)定[2]每組取8只動(dòng)物,切取大腦前極到視交叉處的腦片,分別稱量左腦片濕重;105℃烘干至恒重,即干重。按下列公式計(jì)算腦含水量,腦含水量(%)=[腦濕重(g)-腦干重(g)]/腦濕重(g)×100%。

        1.3.6 血漿中6-keto-PGF1α和TXB2的測(cè)定斷頭取腦的同時(shí),取血3m1于EDTA抗凝離心管中混勻,4℃離心15 min(3500 r/min),分離血漿,放置于-20℃保存。而后按放免試劑盒說明,自動(dòng)γ計(jì)數(shù)器預(yù)先編程,直接測(cè)出樣品濃度。

        2 結(jié)果

        2.1 對(duì)大鼠行為障礙的影響 局灶性腦缺血再灌注后,除假手術(shù)組外,所有動(dòng)物出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)運(yùn)動(dòng)功能障礙,模型組尤為明顯,主要表現(xiàn)為跛行和手術(shù)對(duì)側(cè)癱瘓。經(jīng)蚓激酶及復(fù)方丹參注射液治療后,腦缺血大鼠的行為障礙有不同程度的改善,結(jié)果見附表1。

        2.2 對(duì)大鼠腦梗塞范圍的影響 假手術(shù)組大鼠腦組織呈均勻一致的玫瑰紅色,無缺血梗死灶,其他各組大鼠大腦皮質(zhì)均出現(xiàn)蒼白色的梗死灶。與模型組相比,復(fù)方丹參注射液組及蚓激酶組明顯縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗塞面積,結(jié)果見附表1。

        2.3 對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠腦組織含水量的影響 與假手術(shù)組相比,其他各組病灶側(cè)半球含水量明顯增加,復(fù)方丹參注射液及蚓激酶組腦水腫程度較模型組明顯減輕,結(jié)果見附表1。

        2.4 血漿中6-keto-PGF1α和TXB2的水平 與假手術(shù)組相比,腦缺血再灌注模型組大鼠血漿中TXB2及 TXB2/6-keto-PGF1α(T/P)明顯升高。與模型組比較,蚓激酶組和復(fù)方丹參注射液組TXB2及T/P值均明顯降低,而6-keto-PGF1α則明顯高于模型對(duì)照組,結(jié)果見附表2。

        3 討論

        在急性腦血管病中,缺血性腦血管疾病占50%~70%,近年來發(fā)現(xiàn)發(fā)病48h內(nèi),絕大多數(shù)病人的缺血皮質(zhì)已發(fā)生了再灌注。眾所周知,腦缺血后的再灌注是神經(jīng)功能恢復(fù)的基本條件,也是腦組織損傷加重的重要因素。

        蚓激酶具有纖溶酶原激活物的作用,且能與纖維蛋白結(jié)合使其迅速降解,抗血小板聚集、改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,改善微循環(huán)和抑制血栓形成等作用[3]。

        附表1 蚓激酶對(duì)局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠行為障礙、腦梗塞范圍、腦組織含水量影響

        附表2 蚓激酶對(duì)鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血漿TBX2和6-keto-PGF1α及T/P影響

        本研究結(jié)果顯示,蚓激酶能明顯減輕腦水腫、縮小梗塞面積和改善運(yùn)動(dòng)功能,顯示出良好的腦組織保護(hù)作用。

        腦缺血再灌注損傷的病理生理是一個(gè)酶促級(jí)聯(lián)反應(yīng),血栓素與前列腺素系統(tǒng)失衡是其發(fā)生機(jī)制之一。PGI2和TXA2均為花生四烯酸的代謝產(chǎn)物。在正常情況下,PGI2和TXA2保持著動(dòng)態(tài)平衡以維持對(duì)血管及供血的調(diào)節(jié),而病理狀態(tài)下,花生四烯酸代謝異常,導(dǎo)致PGI2和TXA2的比例失調(diào),血小板合成TXA2增多,血管內(nèi)皮細(xì)胞生成PGI2受抑制,血小板呈現(xiàn)高凝狀態(tài),微血管收縮性增強(qiáng)等,導(dǎo)致低灌流,加重缺血組織的損傷。

        測(cè)定PGI2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物6-keto-PGF1α和 TXA2的穩(wěn)定代謝產(chǎn)物TXB2作為指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)表明,TXB2及T/P值明顯升高(P<0.01),而蚓激酶組能抑制腦缺血再灌注模型大鼠血漿中TXB2的生成,同時(shí)增加6-keto-PGF1α在血漿中的含量,使T/P比值降低,故認(rèn)為蚓激酶有良好的腦組織保護(hù)作用,增強(qiáng)纖溶系統(tǒng)活性,抑制血小板聚集,減慢TXA2合成,改善血管內(nèi)皮細(xì)胞功能,升高PGI2,降低T/P是其對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷保護(hù)機(jī)制之一。

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