蔡 靳，趙 婷，惠伯棣*，宮 平

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

酸漿宿萼中β-隱黃質(zhì)體外淬滅單線態(tài)氧能力評(píng)價(jià)

蔡 靳，趙 婷，惠伯棣*，宮 平

(北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，北京 100191)

目的：從酸漿(Physalis alkengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)宿萼中制備β-隱黃質(zhì)(β-cryptoxanthin)，應(yīng)用微弱發(fā)光測(cè)量方法對(duì)β-隱黃質(zhì)體外淬滅單線態(tài)氧的能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：用正己烷萃取酸漿宿萼中的β-隱黃質(zhì)酯后經(jīng)皂化獲得單體，使用C18-HPLC-PDA對(duì)制備物進(jìn)行定性和定量。用次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)產(chǎn)生單線態(tài)氧，使用微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x檢測(cè)制備組分淬滅單線態(tài)氧的能力。結(jié)果：經(jīng)C18-HPLC-PDA鑒定，制備物中的類胡蘿卜素主要為β-隱黃質(zhì)。微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x的數(shù)據(jù)顯示：β-隱黃質(zhì)的存在能減少次氯酸鈉-雙氧水單線態(tài)氧體系中產(chǎn)生的最大光子計(jì)數(shù)，且存在量效關(guān)系。0.049～0.49g/L的β-隱黃質(zhì)可減少50%的最大光子計(jì)數(shù)。

宿萼；β-隱黃質(zhì)；單線態(tài)氧

Abstract：Objective:To assess the ability ofβ-cryptoxanthin from the calyx ofPhysalisalkengiL. var.franchetii(Mast.)Makino to quenchin vitrosinglet oxygen. Methods:β-cryptoxanthin eater was extracted from the calyx ofPhysalisalkengiL.var.franchetii(Mast.) Makino withn-hexane and then saponified to produceβ-cryptoxanthin fraction. The fraction was identified and quantified on C18-HPLC-PDA. Based on the reaction between NaClO and H2O2, singlet oxygen was produced. Singlet oxygen quenching ability of theβ-cryptoxanthin fraction was determined on ultra-weak luminescience analyzer. Results:By C18-HPLCPDA, the prepared fraction was identified asβ-cryptoxanthin. The data from ultra-weak luminescience analyzer suggested that theβ-cryptoxanthin fraction was able to reduce the maximum number of photon generated from the reaction solution in positive correlation with its amount.β-Cryptoxanthin with an amount ranging between 0.049 g/L and 0.49 g/L resulted in a 50% reduction of maximum photon number.

Key words：calyx；β-cryptoxanthin；singlet-oxygen

酸漿(Physalis alkengiL. var.franchetii(Mast.) Makino)為茄科(Solanaceae )酸漿屬(P.alkekengi)的一種多年生草本植物，又名“紅姑娘”、“紅燈籠”等。酸漿果實(shí)為球狀漿果，外部的宿萼寬大，呈燈籠形囊狀。酸漿原產(chǎn)于中國(guó)，南北方均有野生品種[1]。酸漿的根及全草可入藥，被列入《本草綱目》，具有清熱、利咽、化痰、利尿等功能。酸漿的果實(shí)可生食、糖制、醋漬或制果漿，宿萼有顯著的清熱解毒功能[2]。酸漿的果實(shí)和宿萼中含有豐富的類胡蘿卜素，其中包括β-隱黃質(zhì)酯[3-5]。酸漿的果實(shí)和宿萼中的β-隱黃質(zhì)酯可被水解制成β-隱黃質(zhì)單體。

β-隱黃質(zhì)(β-cryptoxanthin)為一種天然類胡蘿卜素，其化學(xué)結(jié)構(gòu)已完全明確(圖1)，系統(tǒng)命名為3-羥基-β-胡蘿卜素，分子式為C40H56O，平均相對(duì)分子質(zhì)量為552.872[4]。近幾年的研究表明β-隱黃質(zhì)具有預(yù)防心血管疾病、提高免疫力、抗癌等多種功能，可成為食源中重要的功能因子[4-5]。

圖1 β-隱黃質(zhì)Fig.1 Molecular structure ofβ-cryptoxanthin

單線態(tài)氧(1O2)是處于激發(fā)態(tài)的分子氧。在許多生命活動(dòng)中單線態(tài)氧都起著重要的作用，與生物膜損傷、細(xì)胞衰老和癌癥等疾病有密切關(guān)系。在本項(xiàng)研究中，使用次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系產(chǎn)生單線態(tài)氧(1O2)(式(1))。該反應(yīng)在產(chǎn)生單線態(tài)氧的同時(shí)定量釋放光子。

微弱發(fā)光測(cè)量技術(shù)[8]是將發(fā)光的生物或化學(xué)樣品置于黑暗的環(huán)境中，用靈敏度極高的光子計(jì)數(shù)器接受來自樣品的微弱光，將其轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，從而獲得樣品的發(fā)光信息[6-9]。在本研究中，用微弱化學(xué)發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系產(chǎn)生的光子計(jì)數(shù)，以反映單線態(tài)氧產(chǎn)生的數(shù)量。本研究擬從β-隱黃質(zhì)淬滅單線態(tài)氧能力的角度探索其健康功能的量效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酸漿來自于河北秦皇島地區(qū)。

甲醇、乙醇、正己烷、30%過氧化氫、氫氧化鉀、次氯酸鈉、四氫呋喃均為分析純?cè)噭?北京化工廠；乙腈、乙酸乙酯均為色譜純 迪馬公司；柱層析用硅膠(60～100目) 青島海洋化工廠。

1.2 儀器與設(shè)備

Jasco PU-2080 Plus溶劑輸送系統(tǒng)；Jasco UV-2075檢測(cè)器；Superiorex ODS S5色譜柱(4.6mm×150mm，5μm) Shiseido公司；MultiSpec-1501型紫外-可見分光光度計(jì) Shimadzu公司；BPCL-2-JZSH型(雙反應(yīng)池)微弱發(fā)光分析儀 中國(guó)科學(xué)院生物物理研究所。

1.3 方法

1.3.1 酸漿宿萼中總類胡蘿卜素的萃取

將干燥(含水量為13%)的酸漿宿萼剝離，放入粉碎機(jī)中進(jìn)行粉碎。粉碎的樣品過20目標(biāo)準(zhǔn)篩，收集20目以下組分。稱取1kg 20目以下的樣品粉末置于大三角瓶?jī)?nèi)，加入4L正己烷，進(jìn)行30min齒式攪拌(120r/min)后使用負(fù)壓抽濾，收集濾出的萃取液。殘?jiān)貜?fù)萃取6次。合并收集的萃取液，將其置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器的旋轉(zhuǎn)瓶中，在－0.08MPa條件下進(jìn)行濃縮脫溶，由于萃取液體積較大，濃縮溫度定為45℃。收集濃縮物。

1.3.2 β-隱黃質(zhì)的制備

稱取1g濃縮物溶于50mL正己烷中，形成真溶液。配制10g/100mL KOH-乙醇溶液。將濃縮物的正己烷溶液與10g/100mL KOH-乙醇溶液按體積比1:1比例混合。混合液在充氮、避光和攪拌條件下反應(yīng)過夜。將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，用稀鹽酸將pH值調(diào)至中性，加入等體積的水，搖勻，靜置10min，棄去下相，反復(fù)多次。收集上相，在40℃、－0.08MPa的條件下濃縮至適當(dāng)體積，保持濃縮物為真溶液。

在26cm×1.8cm直徑的層析柱中干法裝填硅膠固定相。用正己烷潤(rùn)洗柱床。將濃縮物上樣，用正己烷洗脫6個(gè)柱體積后改用95%的乙醇溶液。樣品在柱上可分為兩個(gè)明顯的色帶。收集先洗脫下來的色帶組分在40℃、－0.08MPa的條件下濃縮脫溶。

1.3.3 β-隱黃質(zhì)制備物中類胡蘿卜素組成的C18-HPLC分析

定量稱取β-隱黃質(zhì)制備物，使用丙酮溶解并定容。溶液10000r/min離心10min。取上清液用于HPLC分析。

HPLC條件：色譜柱為Superiorex ODS S5(4.6mm×150mm，5μm)；流動(dòng)相A為乙腈-水(9:1，V/V)；流動(dòng)相B為乙酸乙酯。線性梯度洗脫：B在20min內(nèi)從0%升至100%，流速為1mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為450nm，進(jìn)樣量為20L[4]。依據(jù)各組分的保留時(shí)間，參考惠伯棣等[4]的報(bào)道對(duì)各組分定性。測(cè)定各組分的峰面積，計(jì)算β-隱黃質(zhì)在總類胡蘿卜素中所占比例(式2)。如果β-隱黃質(zhì)在總類胡蘿卜素中所占比例超過97%，采用UV-VIS法測(cè)定組分中β-隱黃質(zhì)的純度。

1.3.4 β-隱黃質(zhì)制備物純度的UV-VIS測(cè)定

稱取一定量β-隱黃質(zhì)制備物，用正己烷定容。用紫外-可見光分光光度計(jì)測(cè)量溶液在449nm波長(zhǎng)處的吸光度，并根據(jù)公式(3)計(jì)算其中β-隱黃質(zhì)的含量[4-5]。

式中：x為樣品中β-隱黃質(zhì)的含量/g；V為樣品溶液的體積/mL；A為樣品溶液在449nm波長(zhǎng)處的吸光度；A1%1cm為吸光系數(shù)，在1 cm光程長(zhǎng)的比色杯中1g/100mL質(zhì)量濃度溶質(zhì)的理論吸收值，在此為2200。

1.3.5 β-隱黃質(zhì)制備物體外淬滅單線態(tài)氧能力測(cè)定

稱取一定量β-隱黃質(zhì)制備物濃縮物溶于四氫呋喃中，配制4.9、0.49、0.049和0.0049g/L質(zhì)量濃度的β-隱黃質(zhì)樣品液。

微弱發(fā)光測(cè)量?jī)x (BPCL)測(cè)量條件及測(cè)量方法：雙樣品數(shù)據(jù)采集間隔為0.1s，收集時(shí)間50s。在樣品測(cè)量杯中順次加入0.15mL次氯酸鈉和0.1mL樣品，混勻后將測(cè)量杯放入樣品池中，關(guān)閉檢測(cè)室門，啟動(dòng)接收光子計(jì)數(shù)信號(hào)，待基線穩(wěn)定后，注入0.15mL雙氧水，同時(shí)開始計(jì)時(shí)記錄光子計(jì)數(shù)信號(hào)。在參比樣品測(cè)量杯中的操作同上，樣品溶液被換為四氫呋喃。記錄每個(gè)樣品的反應(yīng)時(shí)間-光子計(jì)數(shù)圖。由于該反應(yīng)受到多種環(huán)境因素的影響，為確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的真實(shí)性，每個(gè)樣品至少重復(fù)3次，結(jié)果取平均值。按式(4)計(jì)算淬滅率[10-12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-隱黃質(zhì)制備物的類胡蘿卜素組成

酸漿宿萼中的β-隱黃質(zhì)是以酯的形式存在，經(jīng)過皂化可水解成單體。這一過程在惠伯棣等[4]的報(bào)道中已詳盡描述。在本研究中，皂化產(chǎn)物采用柱層析純化制備β-隱黃質(zhì)。根據(jù)惠伯棣等[4]的報(bào)道，圖2中保留時(shí)間為11.92min的組分為β-隱黃質(zhì)，β-隱黃質(zhì)在制備物中的總類胡蘿卜素構(gòu)成上占有很大比例。根據(jù)歸一化法計(jì)算達(dá)98.1%。

圖2 β-隱黃質(zhì)制備物的C18-HPLC色譜圖Fig.2 C18-HPLC profile of the preparedβ-cryptoxanthin fraction

2.2 β-隱黃質(zhì)制備物中β-隱黃質(zhì)的含量

圖3 β-隱黃質(zhì)制備物的電子吸收光譜圖Fig.3 Electronic absorption spectrum of the preparedβ-cryptoxanthin fraction inn-hexane

由于β-隱黃質(zhì)制備物中β-隱黃質(zhì)占總類胡蘿卜素含量的比例很大，其中β-隱黃質(zhì)的含量可用UV-VIS法測(cè)定，測(cè)定結(jié)果顯示：制備物中β-隱黃質(zhì)單體含量為9.956%。圖3為從UV-VIS上獲得的β-隱黃質(zhì)制備物電子吸收光譜圖。該光譜的特征包括最大吸收波長(zhǎng)和VIII/VII值與已報(bào)道的β-隱黃質(zhì)的光譜特征一致[4]。

2.3 β-隱黃質(zhì)制備物淬滅單線態(tài)氧能力的測(cè)定

圖4 次氯酸鈉-雙氧水反應(yīng)體系的時(shí)間-光子計(jì)數(shù)圖Fig.4 Time-photon count profile of NaClO/H2O2reaction

由圖4可知，當(dāng)反應(yīng)體系中存在β-隱黃質(zhì)制備物時(shí)，反應(yīng)體系的最大光子計(jì)數(shù)值降低。降低的程度與體系中β-隱黃質(zhì)的量有關(guān)。隨著體系中β-隱黃質(zhì)的量增加，淬滅率也增加。

圖5 β-隱黃質(zhì)質(zhì)量濃度變化對(duì)β-隱黃質(zhì)制備物對(duì)單線態(tài)氧淬滅率的影響Fig.5 Effect of varying amounts ofβ-cryptoxanthin on its singlet oxygen quenching capacity

由圖5可知，反應(yīng)體系中β-隱黃質(zhì)的含量增加，光子的淬滅率也增加，換言之，單線態(tài)氧的淬滅率亦增加。

3 討 論

本研究結(jié)果表明，β-隱黃質(zhì)具有體外淬滅單線態(tài)氧的能力，50%淬滅作用劑量范圍在0.049～0.49g/L范圍內(nèi)。根據(jù)李京等[10]、廖萍泰等[11-12]的報(bào)道，全反式番茄紅素和反式葉黃素單體的50%淬滅率作用劑量也都在10-2～10-1g/L范圍內(nèi)，與β-隱黃質(zhì)相同。三者的分子結(jié)構(gòu)見圖6。

圖6 番茄紅素(a)、葉黃素(b)和β-隱黃質(zhì)(c)的分子結(jié)構(gòu)Fig.6 Molecular structures of lycopene (a), lutein (b) andβ-cryptoxanthin (c)

圖6顯示：番茄紅素、葉黃素與β-隱黃質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)差異在于末端基團(tuán)，三者有開閉環(huán)和羥基數(shù)量之分。從三者淬滅單線態(tài)氧能力相比較得出：環(huán)狀末端基團(tuán)和環(huán)上的羥基對(duì)分子淬滅單線態(tài)氧的能力無顯著影響，3種類胡蘿卜素淬滅單線態(tài)氧的能力是相似的。從分子結(jié)構(gòu)上判斷，其淬滅單線態(tài)氧的能力主要由分子中央共軛多烯鏈決定。

[1] 李力瑩, 龐忠義, 吳銀鈴. “紅姑娘”的用途與栽培技術(shù)[J]. 中國(guó)野生植物資源, 2001, 16(2):94.

[2] 馬艷麗. 酸漿的化學(xué)成分分析及其利用價(jià)值的研究[J]. 長(zhǎng)春大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 12(3):21-22.

[3] 帕提古麗, 馬合木提高莉, 史博, 等. 酸漿花萼色素的提取及理化性質(zhì)研究[J]. 食品科學(xué), 2004, 25(9):35-38.

[4] 惠伯棣, 王亞靜, 裴凌鵬, 等. 酸漿漿果和宿萼中的類胡蘿卜素組成分析[J]. 中國(guó)醫(yī)學(xué)雜志, 2006, 41(4):583-585.

[5] 惠伯棣. 類胡蘿卜素化學(xué)與生物化學(xué)[M]. 北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社,2005:162-169.

[6] 徐向榮, 王文華, 李華斌. 化學(xué)發(fā)光法測(cè)定Fenton反應(yīng)中的羥自由基的建立[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 1998, 18(6):68-71.

[7] 陳秀武, 胡天喜. 測(cè)定羥自由基產(chǎn)生與清除的化學(xué)發(fā)光體系[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 1992, 19(2):136-139.

[8] 趙文恩. 類胡蘿卜素抗氧化性質(zhì)的研究[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 24(1):38-46.

[9] 陳瑗, 周玫. 自由基醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)與病理生理[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2002:53.

[10] 李京, 惠伯棣. 幾何異構(gòu)化對(duì)番茄紅素淬滅單線態(tài)氧功能的影響[J].食品科學(xué), 2007, 28(8):104-107.

[11] 廖萍泰, 惠伯棣. 葉黃素的體外抗氧化功能[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè),2005, 31(4):46-50.

[12] 惠伯棣, 裴凌鵬, 李京, 等. 萬(wàn)壽菊花中葉黃素及其酯體外淬滅單線態(tài)氧能力的比較[J]. 中國(guó)藥學(xué)雜志, 2006, 41(18):1385-1387.

in vitroSinglet Oxygen Quenching Ability Assessment ofβ-Cryptoxanthin from the Calyx ofPhysalis alkengiL.var.franchetii(Mast.) Makino

CAI Jin，ZHAO Ting，HUI Bo-di*，GONG Ping
(College of Applied Arts and Science, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

TS264.4

A

1002-6630(2010)17-0158-04

2010-06-03

“十一五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2008BAI58B06)

蔡靳(1987—)，女，本科，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)制備及生理功能。E-mail：cj088@tom.com

*通信作者：惠伯棣(1959—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)轭惡}卜素生物化學(xué)。E-mail：bodi_hui@ygi.edu.cn