賈紹華,張舜堯,彭海生

姜黃素(Curcumin)是從姜科植物姜黃(curcuma longa L.)的根莖中提取的一種酚類色素,不溶于水,易溶于冰醋酸和堿性溶液[1].研究表明,姜黃素具有多方面的藥理活性,如抗氧化、利膽抗炎、抗凝、降血脂及抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗腫瘤[2]等作用外,還具有提高免疫功能的作用[3-5].前期實(shí)驗(yàn)研究表明,姜黃素能夠顯著地升高紅細(xì)胞黏附腫瘤細(xì)胞的花環(huán)率,提高紅細(xì)胞C3b受體花環(huán)促進(jìn)率,降低其抑制率及提高紅細(xì)胞膜的流動(dòng)性[6].本實(shí)驗(yàn)繼續(xù)從紅細(xì)胞免疫出發(fā),通過其對(duì)紅細(xì)胞膜唾液酸水平和封閉度的影響的研究來進(jìn)一步探討姜黃素抗腫瘤的作用機(jī)制.

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

1.1 主要藥品及試劑

姜黃素(純度≥99%,購自四川金郁金科技開發(fā)有限公司.以二甲亞砜(DMSO)作為溶劑,稀釋成0.1 mmol/L的溶液,等量分裝,-20℃保存[7]);5-Fu(上海旭東海普藥業(yè)有限公司);考馬斯亮藍(lán)蛋白定量試劑盒;SA試劑盒(南京建成生物工程研究所);皂素(上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站);DPH(Sigma公司)等.

1.2 動(dòng)物及瘤株

昆明種小鼠,雌雄各半,體重(20±2)g,由哈爾濱市漢方實(shí)驗(yàn)鼠類養(yǎng)殖所提供,合格證號(hào):00101006.瘤株:H22荷瘤小鼠,購自哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院.

1.3 主要儀器

RF-540熒光分光光度計(jì)(日本島津公司);紫外721分光光度計(jì)(山東高密分析儀器廠);水平高速離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠);低溫超速離心機(jī)(美國貝克曼公司).

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、建立模型和給藥

小鼠按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為5組,每組10只.給藥組分別為姜黃素高(200 mg/kg)、中(100mg/kg)、低(50mg/kg)劑量組,陽性對(duì)照組選用5-Fu組(30 mg/kg),模型對(duì)照組給予相同體積的生理鹽水.無菌條件下抽取生長狀態(tài)良好的H22荷瘤小鼠腹水,以生理鹽水(1∶4)稀釋后,使腫瘤細(xì)胞數(shù)為5.6×105個(gè)/mL.每只0.2m L接種于各組小鼠腹腔,接種24 h后.次日各組小鼠sc注射相應(yīng)試劑.每天1次,連續(xù)給藥7 d,于次日處死.

2.2 紅細(xì)胞膜SA水平的測(cè)定

使用試劑盒對(duì)紅細(xì)胞膜蛋白定量并測(cè)定SA水平,用分光光度計(jì)于560 nm波長處,讀取各管吸光度(A)值.

2.3 紅細(xì)胞膜封閉度的測(cè)定

2.3.1 紅細(xì)胞影泡的制備

1)不封閉影泡的制備

給藥7 d后次日小鼠眼球取血,肝素抗凝,在水平高速離心機(jī)下3 000 r/min離心10min,以生理鹽水(1∶3)洗滌2次,1∶1懸浮在生理鹽水中,得到紅細(xì)胞懸液,按1∶30加入預(yù)冷的雙蒸水或5P 8.4的等滲磷酸緩沖液(PBS),4℃下溶血,過夜,制成紅細(xì)胞溶血液.4℃下以2 000 r/min離心40 min,棄上清液,用5P8.4PBS洗滌3次,最后懸浮在一定量PBS中,制成影泡懸浮液.

2)封閉影泡的制備

影泡懸浮液在37日℃下水浴1 h,可獲得封閉影泡.

2.3.2 NADH-細(xì)胞色素C氧化還原酶活性的測(cè)定

按Zamudio[8]法進(jìn)行:取4個(gè)試管,分別為不加皂素空白管(A),不加皂素樣品管(B),加皂素空白管(C),加皂素樣品管(D).首先在A、B、C、D管中都加入0.6 m L封閉影泡,第2步加入5P8.4的PBS,A管2.4mL,B管2.2 mL,C管2.2mL,D管2.0mL;第3步A、B管不加試劑,C、D管加入0.1%皂素各0.2mL;第4步A、C管不加試劑,B、D管加入5mmol/L K3Fe(CN)6各0.1 mL放置10m in;第5步A、C管不加任何試劑,B、D管各加6mmol/LNADH 0.1mL,加完計(jì)時(shí)1min后,混勻,在波長420 nm處比色,以加入NADH為起點(diǎn),記錄反應(yīng)開始6min內(nèi)的吸光度值(每隔1 min記錄1次).上述反應(yīng)在25℃進(jìn)行.比色對(duì)照,除不加NADH溶液外其他操作同上.

2.3.3 紅細(xì)胞膜封閉度的計(jì)算方法:

封閉度=(加表面活性劑酶活力-不加表面活性劑酶活力)/加表面活性劑酶活力 ×100%

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 姜黃素對(duì)H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜SA水平的影響

結(jié)果見表1.結(jié)果顯示,與對(duì)照組比較,姜黃素低、中、高劑量組均可顯著地提高H22小鼠紅細(xì)胞膜上SA水平(P＜0.05),且陽性對(duì)照組5-Fu也可提高SA水平.

表1 姜黃素對(duì)H 22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞膜表面唾液酸含量的影響n=10)

表1 姜黃素對(duì)H 22荷瘤小鼠腫瘤細(xì)胞膜表面唾液酸含量的影響n=10)

注:與陰性對(duì)照組比較:*P＜0.05

組別 劑量/(mg?kg-1)SA/(mmol?L-1)封閉度/%對(duì)照組 —0.1854±0.0146 48.41±1.31 5-Fu組30 0.2263±0.0036*56.06±2.57*Cur組50 0.2029±0.0176*54.52±3.03*100 0.2253±0.0046*59.11±1.69*200 0.2355±0.0124*62.84±3.69*

3.2 姜黃素對(duì)H22荷瘤小鼠紅細(xì)胞膜封閉度的影響

結(jié)果見表1與對(duì)照組比較,姜黃素低、中、高劑量組均可顯著地提高H22小鼠紅細(xì)胞膜上唾液酸含量(P＜0.05),且陽性對(duì)照組5-Fu也具有相似的結(jié)果.

4 討 論

姜黃素具有抗腫瘤作用是其重要藥理活性之一,包括誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、分化及增殖等作用,本身還具有免疫增強(qiáng)作用.M Churchill等研究[9]表明姜黃素可以通過提高實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的CD4(+)T細(xì)胞和B細(xì)胞水平來提高動(dòng)物的免疫活性.紅細(xì)胞為機(jī)體內(nèi)重要的血細(xì)胞,也是機(jī)體內(nèi)重要的免疫細(xì)胞,1981年Siegel[10]提出了紅細(xì)胞免疫系統(tǒng)(Red-cell immune system)的新概念,開辟了機(jī)體免疫系統(tǒng)的新領(lǐng)域.現(xiàn)已證實(shí),紅細(xì)胞具有識(shí)別、黏附、殺傷抗原、清除免疫復(fù)合物,而且參與機(jī)體免疫調(diào)控,其本身還存在有完整的自我調(diào)控系統(tǒng),是完整機(jī)體免疫系統(tǒng)中的一個(gè)子系統(tǒng)[11].

唾液酸是細(xì)胞膜上糖蛋白和糖脂糖鏈末端的殘基,廣泛分布于哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜表面,為細(xì)胞負(fù)電荷的主要來源,亦為細(xì)胞膜受體的重要成分[12],參與細(xì)胞分化、癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移、細(xì)胞的識(shí)別、黏附和接觸抑制等生理過程,決定著細(xì)胞膜的重要特征.因此,細(xì)胞膜上唾液酸含量的改變將導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)一系列生物學(xué)變化.紅細(xì)胞免疫功能隨著腫瘤的發(fā)展呈下降趨勢(shì),在腫瘤侵襲早期和中期下降最為迅速,而腫瘤轉(zhuǎn)移開始至腫瘤轉(zhuǎn)移晚期以后,其下降速度減慢,認(rèn)為這一改變可作為評(píng)估腫瘤發(fā)展程度的參考指標(biāo)之一.紅細(xì)胞膜表面亦含有唾液酸,腫瘤患者紅細(xì)胞膜表面SA的減少,促進(jìn)紅細(xì)胞的老化,脆性增加,細(xì)胞易崩解破裂,影響紅細(xì)胞的正常生理功能.實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,姜黃素可以顯著地提高H22荷瘤小鼠唾液酸和封閉度水平,增強(qiáng)細(xì)胞膜活性而達(dá)到提高紅細(xì)胞免疫功能的目的.

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