馬 寧 張吉平 劉 靜

（1.徐州醫(yī)學(xué)院附屬連云港醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 連云港 222002；2.蘭州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030）

腺苷酸激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是一種重要的絲/蘇氨酸蛋白激酶，在調(diào)解糖、脂肪、蛋白質(zhì)代謝中發(fā)揮著重要作用。最近許多研究表明AMPK可能在2 型糖尿病的運(yùn)動(dòng)治療中發(fā)揮了重要作用，故AMPK 對(duì)糖脂代謝的影響受到高度重視，相關(guān)研究也日趨深入。2型糖尿病患者普遍存在胰島素抵抗，有證據(jù)表明AMPK通過(guò)影響脂代謝在改善胰島素抵抗方面發(fā)揮重要作用[1]。因此，我們通過(guò)單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphism，SNP)研究方法分析AMPKα2亞單位編碼基因PRKAA2與2型糖尿病患者血脂的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

按照世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）1999年診斷標(biāo)準(zhǔn)隨機(jī)選擇104例糖尿病患者。

1.2 方法

①用酚/氯仿法抽取基因組DNA；②位點(diǎn)選擇：使用SNPbrowser軟件，按照pairwise r2算法選擇PRKAA2基因標(biāo)簽SNP（Tagging SNP，tSNP）。設(shè)定R2=0.8，MAF=0.2，選擇rs2796495位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)；③PCR擴(kuò)增：上游引物5′ctcacatcactgctaggaaacc3′，下游引物5′taggactcatacccaaacg3′。擴(kuò)增采用降落PCR，即95℃預(yù)變性3 min，繼之95℃變性30 s，59℃退火30 s，72℃延伸45 s，每5個(gè)循環(huán)退火溫度降低2℃直至53℃，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸7 min；④ 突變檢測(cè)：擴(kuò)增樣本經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后用變性高效液相色譜儀檢測(cè)突變。上樣量為5 μL，退火溫度經(jīng)WAVE軟件分析后確定為54.5℃。所有樣本經(jīng)第一次檢測(cè)后隨機(jī)抽取單峰樣本和非單峰樣本測(cè)序，確定其基因型（樣本送上海生工進(jìn)行測(cè)序）。將所有單峰樣本與測(cè)序野生型樣本等體積混合，經(jīng)變性退火后進(jìn)行第二次DHPLC檢測(cè)，以區(qū)分野生型和純和突變。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

Hardy-Weinberg平衡定律檢測(cè)基因型群體代表性。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。計(jì)量資料兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。不滿足正態(tài)分布和方差齊性時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。采用SPSS 11.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以P＜0.05（雙側(cè)）為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

經(jīng)Hardy2Weinberg 遺傳平衡定律檢驗(yàn)χ2=0.0049，P=0.944，表明各基因型頻率已達(dá)遺傳平衡，具有群體代表性(表1)。

2 結(jié)果

2.1 基因頻率分布

表1 rs2796495不同基因型者一般資料比較(±s)

表1 rs2796495不同基因型者一般資料比較(±s)

基因型 CC CT TT例數(shù)(n)（男/女）43(28/15) 48(32/16) 13(8/5)年齡(歲) 55±2 58±2 56±3體重指數(shù)(kg/m2)24.36±0.55 24.61±0.42 26.00±0.68空腹血糖(mmoL/L)11.47±0.96 12.44±0.95 13.96±2.28 2小時(shí)血糖(mmoL/L)17.41±1.12 18.69±1.47 18.74±3.07

2.2 不同基因型間血脂水平比較

總膽固醇（TC）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）比較顯示三組間不完全相同，P值分別為0.018、0.012。CC、CT、TT三組間總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇依次升高，其中CC與TT型比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P值分別為0.047、0.028。但是經(jīng)年齡、性別、體重指數(shù)校正后TC間的差異失去統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.086），LDL-C間的差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.037）(表2)。

表2 rs2796495基因型間血脂水平比較(±s)

表2 rs2796495基因型間血脂水平比較(±s)

注：a：CC型與TT型比較P＜0.05，b：CT型與TT型比較P＜0.05，c：經(jīng)自然對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

基因型 總膽固醇 甘油三脂c 高密度脂蛋白膽固醇c 低密度脂蛋白膽固醇(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)(mmoL/L)CC 4.51±1.41a 2.11±0.98 0.93±0.29 1.95±0.76a CT 4.96±1.24 1.84±0.82 0.92±0.21 2.15±0.56 TT 5.51±0.90 2.38±1.92 1.07±0.25 2.55±0.95

3 討論

AMP激活蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）是由α、β、?三個(gè)亞基組成的異源三聚體蛋白，其中α亞基又包括α1、α2兩個(gè)亞單位。不同的亞單位由不同的基因編碼，其中α2亞單位的編碼基因?yàn)镻RKAA2。對(duì)AMPK基因敲除小鼠研究發(fā)現(xiàn)α2基因敲除小鼠出現(xiàn)胰島素抵抗[1]。AMPK蛋白與血脂代謝有著密切關(guān)系。乙酰輔酶A 羧化酶(ACC)和羥甲基戊二酸單酰CoA還原酶(HMGR)分別在脂肪酸和膽固醇的合成中起關(guān)鍵作用[2]。ACC是脂肪酸合成的限速酶，而HMGR為膽固醇合成的限速酶。ACC和HMGR 均是AMPK的靶分子。激活的AMPK可以使它們磷酸化，抑制它們的功能，從而抑制肝脂肪酸和膽固醇的合成[3]。此外AMPK還參與了甘油三酯的調(diào)節(jié)。在脂肪細(xì)胞中，AMPK激動(dòng)劑不僅可通過(guò)ACC 磷酸化而抑制脂肪生成，還可通過(guò)磷酸化抑制激素敏感脂肪酶，從而抑制異丙腎上腺素所誘導(dǎo)的脂肪分解[4]。另外，AMPK能抑制肝細(xì)胞中重要的脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子—固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1）的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)[5]。AMPK這種既調(diào)節(jié)脂肪合成，又對(duì)抗脂肪分解的作用，可以減少血液中游離脂肪酸濃度，減少脂毒性。Horikoshi[6]等研究發(fā)現(xiàn)編碼α2亞單位的基因PRKAA2多態(tài)性與日本人群胰島素抵抗和2型糖尿病有關(guān)。Spencer-Jones[7]等對(duì)英國(guó)正常婦女PRKAA2基因的5個(gè)tSNP位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性均與低密度脂蛋白膽固醇和總膽固醇變化有關(guān)。我們的研究提示編碼AMPKα2亞基的PRKAA2基因的tSNP rs2796495多態(tài)性位點(diǎn)與膽固醇水平相關(guān)，有突變T等位基因的個(gè)體其膽固醇，尤其是低密度脂蛋白膽固醇更高。這與AMPK蛋白的功能相一致?；虻墓δ苁峭ㄟ^(guò)其編碼的蛋白質(zhì)發(fā)揮的，因此考慮rs2796495的變異可能影響到了AMPK蛋白的表達(dá)活性。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示PRKAA2基因標(biāo)簽SNP rs2796495與低密度脂蛋白膽固醇水平密切相關(guān)，其進(jìn)一步的研究對(duì)預(yù)防糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生有一定臨床意義。需強(qiáng)調(diào)的是，該多態(tài)性位點(diǎn)雖然是一個(gè)標(biāo)簽SNP位點(diǎn)，但其位于基因的內(nèi)含子，因此，這一多態(tài)性是否會(huì)直接引起基因的功能或表達(dá)改變，或者僅僅是與真正的致病性多態(tài)性位點(diǎn)呈連鎖不平衡的一個(gè)多態(tài)性標(biāo)志，還有待于進(jìn)一步的研究證實(shí)。

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[7]Spencer-Jones NJ,Ge D,Snieder H,et al.AMP-kinase alpha2 subunit gene PRKAA2 variants are associated with total cholesterol,low-density lipoproteincholesterol and high-density lipoprotein-cholesterol in normal women[J].Journal of medical genetics,2006,43(12):936-942.