田朝光，馬延和

1 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

微生物糖代謝的分子基礎(chǔ)

真菌降解木質(zhì)纖維素的功能基因組學(xué)研究進(jìn)展

田朝光1，馬延和2

1 中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津 300308

2 中國(guó)科學(xué)院微生物研究所 微生物資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100101

木質(zhì)纖維素利用的核心問題之一是生物質(zhì)的降解，即如何將生物質(zhì)由高聚大分子降解為可發(fā)酵的小分子糖，又稱為糖化。自然界中向胞外大量分泌降解生物質(zhì)酶類的微生物主要是真菌，研究真菌木質(zhì)纖維素降解途徑的分子機(jī)理對(duì)生物質(zhì)的綜合利用意義重大，是木質(zhì)纖維素能否實(shí)現(xiàn)全面生物煉制的關(guān)鍵之一。以下將針對(duì)真菌降解木質(zhì)纖維素的研究進(jìn)展，特別是對(duì)利用功能基因組學(xué)所取得的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)述。

木質(zhì)纖維素，真菌，功能基因組

Abstract:Inefficient degradation of lignocellulose is one of the main barriers for the utilization of renewable plant biomass for biofuel production. The bottleneck of the biorefinery process is the generation of fermentable sugars from complicated biomass polymers. In nature, the main microbes of lignocelluloses deconstruction are fungi. Therefore, elucidating the mechanism of lignocelluloses degradation by fungi is of critical importance for the commercialization of lignocellulosic biofuels. This review focuses on the progress in lignocelluloses degradation pathways in fungi, especially on the advances made by functional genomics studies.

Keywords:lignocelluloses, fungi, functional genomics

由于能源供應(yīng)的日益短缺和溫室效應(yīng)的不斷加劇，可再生清潔能源的發(fā)展成為當(dāng)今世界的重要問題[1]。生物質(zhì)能源作為潛力巨大和環(huán)境友好的新能源是各國(guó)都爭(zhēng)相研究的重點(diǎn)[2]。地球上最主要的生物質(zhì)來自綠色植物，主要由 3類大分子組成，含量最多的是纖維素，由成百上千個(gè)葡萄糖分子聚合而成，為地球上存在最豐富的有機(jī)大分子，儲(chǔ)量約為850億t[3]；其次是半纖維素，儲(chǔ)量約為500億t；第三類是木質(zhì)素，由結(jié)構(gòu)復(fù)雜的含芳香環(huán)的有機(jī)分子聚合而成，約占 20%，即 350億 t。如果能夠成功利用儲(chǔ)量巨大的生物質(zhì)能源，人類社會(huì)不僅能源供應(yīng)無須擔(dān)憂，而且由于生物質(zhì)能源不會(huì)增加 CO2排放，使地球溫室效應(yīng)得到控制，具有巨大的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益[4]。

要利用生物質(zhì)，主要有 2個(gè)基本代謝步驟[2]：第一步要將復(fù)雜的生物質(zhì)大分子降解為單糖 (又稱之為糖化，主要產(chǎn)物是葡萄糖和木糖)。這一步目前主要有兩種方法：第一是物理化學(xué)法，如高溫汽爆、強(qiáng)酸處理等，物理法能量消耗巨大，成本很高且對(duì)環(huán)境帶來威脅；另一種是生物酶法，主要是利用真菌來源的纖維素酶系來處理生物質(zhì)得到單糖。由于生物酶法條件溫和、環(huán)境友好而倍受關(guān)注。第二步是將已得到的單糖通過生物轉(zhuǎn)化 (發(fā)酵) 得到各類生物基產(chǎn)品(如乙醇、丁醇等)。

如何將生物質(zhì)降解為單糖是生物質(zhì)利用的重要瓶頸[5]。因?yàn)椴还苁悄姆N降解方法，目前的成本都太高，不具有商業(yè)化能力，從而很難走出實(shí)驗(yàn)室，服務(wù)于人類社會(huì)。要想真正利用生物質(zhì)，必須在生物質(zhì)降解技術(shù)上有所突破。要提高生物質(zhì)降解酶系的效率，傳統(tǒng)誘變技術(shù)已經(jīng)取得了很大進(jìn)步，提升空間有限，必須在生物質(zhì)降解的分子基礎(chǔ)上下功夫、找突破，而新一代各類組學(xué)技術(shù)，為揭示生物質(zhì)降解的分子機(jī)理提供了極為重要的新思路。生物質(zhì)降解分子機(jī)理的闡明，必將大大加快新一代快速高效的纖維素酶系和菌系的研發(fā)進(jìn)程，顯著降低生物質(zhì)的糖化成本，為全面實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的真正利用提供理論支撐。

1 真菌降解木質(zhì)纖維素的功能基因組學(xué)研究進(jìn)展

在自然界能夠降解木質(zhì)纖維素的微生物中，最為重要的是真菌系統(tǒng)。木質(zhì)纖維素降解為小分子糖的整個(gè)過程非常復(fù)雜，至少幾十種酶參與，相互協(xié)同作用，破壞植物細(xì)胞壁的復(fù)雜結(jié)構(gòu)，從而降解木質(zhì)素、纖維素和半纖維素。在木質(zhì)素降解真菌中，研究最多的是隸屬擔(dān)子菌門的白腐菌、褐腐菌和子囊菌門的絲狀真菌 (木霉、脈孢菌、青霉菌等)。隨著組學(xué)時(shí)代的來臨，真菌降解木質(zhì)纖維素的功能基因組學(xué)研究進(jìn)展很快，給深入理解這一復(fù)雜生物學(xué)途徑和生物質(zhì)利用提供了新的思路。

1.1 白腐菌

是一類能夠有效降解木質(zhì)素的真菌，主要是擔(dān)子菌。在白腐菌中，有些優(yōu)先降解利用木質(zhì)素，對(duì)纖維素較少利用，如Phanerochaete chrysosporium，稱之為選擇性去木質(zhì)素 (Selective delignification)；有些白腐菌對(duì)木質(zhì)素利用沒有選擇性 (Non-selective delignification)，能夠同時(shí)降解木質(zhì)素和纖維素，如Trametes versicolor[6]。由于木質(zhì)素呈黃褐色，而纖維素呈白色，所以經(jīng)此類真菌降解后的生物質(zhì)由于去除了木質(zhì)素，富含纖維素而呈現(xiàn)白色，所以稱該類真菌為白腐菌。在白腐菌中，參與木質(zhì)素降解的酶類主要是過氧化物酶 (Peroxidases)，通過對(duì)木質(zhì)素進(jìn)行氧化，將其降解。過氧化物酶有 3類：木素過氧化物酶LiP (Lignin peroxidase)，錳過氧化物酶MnP (Mangase peroxidase)，通用過氧化物酶 VP(Versatile peroxidase)，這 3類酶的功能有一定的分工協(xié)作，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。參與木質(zhì)素降解的另一類研究較多的酶是漆酶 (Laccase)，為一類含銅的多酚氧化酶，廣泛存在于多種木質(zhì)纖維素降解真菌中。與過氧化物酶不同的是，漆酶利用O2分子作為氧化劑，而且通常分子量大于過氧化物酶，可達(dá)到60 kDa以上。與多數(shù)分泌型酶蛋白一樣，過氧化物酶和漆酶都是糖基化蛋白[6-7]。

研究最多的白腐菌是Phanerochaete chrysosporium，其基因組序列于2004年公布[8]。其基因組序列分析和隨后的轉(zhuǎn)錄組和分泌蛋白組研究帶來了許多新的發(fā)現(xiàn)[9-11]。轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，545個(gè)基因或蛋白在木質(zhì)纖維素降解過程中表達(dá)呈現(xiàn)顯著變化。木質(zhì)纖維素培養(yǎng)基與豐富培養(yǎng)基的基因表達(dá)譜比較分析發(fā)現(xiàn)，分別有 208個(gè)基因在碳源限制培養(yǎng)基，163個(gè)基因在氮源限制培養(yǎng)基，136個(gè)基因在纖維素培養(yǎng)基中顯著上調(diào)，包括大量的氧化還原酶、碳水化合物代謝相關(guān)酶 (纖維素內(nèi)切酶、外切酶，木聚糖酶等)、糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在氮缺乏的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)谷氨酸蛋白酶高度表達(dá)。另外有高達(dá)190種功能未知的蛋白，而且部分未知功能蛋白含有信號(hào)肽和CBM結(jié)構(gòu)域，顯然與木質(zhì)纖維素代謝有關(guān)[9]。而在稍早的分泌蛋白研究中發(fā)現(xiàn)，纖維素培養(yǎng)條件和木材培養(yǎng)條件分泌蛋白的表達(dá)譜很相似，大量纖維素類酶表達(dá)分泌。說明對(duì)于木質(zhì)素降解真菌P. chrysosporium，纖維素同樣是很好的木質(zhì)素降解相關(guān)酶類的誘導(dǎo)物[11]，盡管通常認(rèn)為其為選擇性降解木質(zhì)素型(Selective delignification)。在纖維素培養(yǎng)條件下，木聚糖酶的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于木材鋸末的培養(yǎng)物，說明木聚糖酶和纖維素酶是分開調(diào)控的[11]。另外，在P. chrysosporium中，葡萄糖同樣抑制木質(zhì)纖維素酶的表達(dá)，即使在氮饑餓的條件下，葡萄糖同樣抑制木質(zhì)纖維素酶的表達(dá)。在白腐菌基因組中沒有發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)的漆酶基因，取而代之的是與漆酶有著遠(yuǎn)緣關(guān)系的多銅氧化酶MCO (Multicopper oxidases)[8]，說明漆酶可以幫助木質(zhì)素降解，但不是木質(zhì)素降解的必需基因[12]。149個(gè)P450基因的發(fā)現(xiàn)，暗示P450可能與木質(zhì)素降解代謝途徑相關(guān)。綜合起來，各類數(shù)據(jù)說明，木質(zhì)素降解是一個(gè)非常復(fù)雜的問題。功能基因組學(xué)研究顯示很多新基因參與了該過程，為木質(zhì)素降解機(jī)理的研究提供了新的目標(biāo)靶點(diǎn)和思路。但要徹底闡釋木質(zhì)素降解機(jī)理還需要對(duì)功能基因組學(xué)中得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行功能驗(yàn)證，比如基因敲除等，而這些在擔(dān)子菌研究方面，還有許多障礙需要克服。

1.2 褐腐菌

主要類群也屬于擔(dān)子菌，是生態(tài)系統(tǒng)中的重要一員，特別是在自然環(huán)境的碳循環(huán)中，扮演重要角色。褐腐菌 (比如Postia placenta) 主要降解纖維素和半纖維素，不能降解木質(zhì)素，但可以分泌酶類修飾木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)，如木質(zhì)素的去甲基化，使得纖維素和半纖維素充分暴露，從而被降解。這樣，降解后的殘?jiān)饕悄举|(zhì)素，呈現(xiàn)褐色，所以將它們稱為褐腐菌[7]，研究最多的是Postia placenta。2009年，Martinez等分析了P. placenta的基因組、轉(zhuǎn)錄組和分泌組。結(jié)果顯示，P. placenta具有獨(dú)特的胞外酶系統(tǒng)，包括不尋常的胞外糖水解酶 (Glycoside hydrolases，GH)，但沒有發(fā)現(xiàn)纖維素外切酶 (CBH)和纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域家族1 (CBM1)。當(dāng)P. placenta以纖維素為唯一碳源生長(zhǎng)時(shí)，許多半纖維素酶和纖維素內(nèi)切酶有非常高的表達(dá)，而分泌蛋白組的質(zhì)譜分析驗(yàn)證了轉(zhuǎn)錄水平的變化[12]。褐腐菌與白腐菌同屬擔(dān)子菌，但只有后者能夠降解木質(zhì)素，這一降解途徑的進(jìn)化機(jī)理也吸引了不少科學(xué)家去探索。到底褐腐菌Postia placenta有沒有木質(zhì)素降解基因呢？基因組分析沒有發(fā)現(xiàn) 3類過氧化物酶基因 (LiP，MnP 和 VP) 和漆酶基因，與其不能降解木質(zhì)素相一致[8,12]。

1.3 里氏木霉Trichoderma reesei

里氏木霉Trichoderma reesei是最著名的纖維素降解真菌，屬于子囊菌。二戰(zhàn)期間在美軍軍營(yíng)發(fā)現(xiàn)[13]，在隨后的60多年研究中，經(jīng)過不斷的誘變篩選，里氏木霉細(xì)胞外纖維素酶的產(chǎn)量可達(dá)40 g/L，有報(bào)道聲稱達(dá)到100 g/L[14]，是至今為止發(fā)現(xiàn)的各類纖維素降解微生物中最高的。盡管誘變育種取得了顯著進(jìn)展，但纖維素酶的成本依然很高，仍然需要顯著提高效率，降低用酶量。加上對(duì)纖維素酶表達(dá)分泌及其調(diào)控機(jī)理都知之甚少，這些都需要從生物學(xué)分子基礎(chǔ)上加大研究，提供思路。功能基因組學(xué)使人們可以從整個(gè)基因組水平來探索這些問題，給許多分子操作困難的物種帶來新的研究思路。里氏木霉由于是商業(yè)纖維素酶的主要生產(chǎn)菌種，受到的關(guān)注和研究眾多。2008年其基因組序列測(cè)序完成，發(fā)展了基因克隆等遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)?；蚪M分析結(jié)果顯示，Trichoderma reesei基因組含有 200個(gè)糖水解酶(GH)，與該綱其他絲狀真菌 (Neurosproa crassa171，Magnaporthe grisea231，F(xiàn)usarium graminearum243) 的平均值215相差不大。但含有的纖維素結(jié)合蛋白卻是數(shù)目最少的，只有36個(gè)，其中經(jīng)典纖維素酶 (endo- 和 exo-) 是最少的，只有11個(gè)[15]。前文提到木霉分泌蛋白量可以高達(dá)100 g/L，所以，其分泌途徑備受關(guān)注，基因組數(shù)據(jù)分析表明，里氏木霉含有較多的分泌途徑相關(guān)基因，如蛋白質(zhì)降解途徑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因和分泌相關(guān)的膜融合蛋白基因，均多于釀酒酵母[15]。里氏木霉基因組的另一個(gè)特點(diǎn)是許多糖水解酶在基因組中呈簇分布，可能有利于此類基因表達(dá)的高效調(diào)控。比較基因組學(xué)也是闡釋生物學(xué)機(jī)理的重要手段，特別是對(duì)于研究誘變獲得的高產(chǎn)菌株的生物學(xué)機(jī)理。通過比較原始出發(fā)菌株和誘變后菌株的基因組水平差異，與性狀聯(lián)系起來分析，有望揭示突變株纖維素酶高產(chǎn)的機(jī)理。RUT C30是公開可以得到的最高產(chǎn)酶菌株，纖維素酶產(chǎn)量可以達(dá)到40 g/L。它是由原始菌株Q6a經(jīng)過兩輪誘變 (Q6a→M7→RG14→RUT C30) 得到。2009年，美國(guó)科學(xué)家通過新一代測(cè)序技術(shù)將兩輪誘變中得到的菌株 (RG14，RUT C30) 基因組測(cè)序，從中窺探到纖維素酶高產(chǎn)菌株的奧秘[16]。比較基因組學(xué)分析顯示，在高產(chǎn)菌株RUT C30基因組中，與原始菌株相比，至少有 223個(gè)單核苷酸突變 (SNP)：包括 43個(gè)氨基酸變化的突變，功能分布在細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)、mRNA穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和分泌途徑等；15個(gè)小的基因組缺失或插入。另外有18個(gè)大的缺失，總的缺失基因組高達(dá)80 kb，其中含有10個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，包括調(diào)控葡萄糖阻遏途徑的轉(zhuǎn)錄因子Cre1。這些缺失的轉(zhuǎn)錄因子對(duì)木霉纖維素降解途徑的調(diào)控可能有重要作用。

1.4 粗糙脈孢菌Neurospora crassa

粗糙脈孢菌Neurospora crassa是一種模式真菌，作為生物醫(yī)學(xué)研究的模式生物已有80年研究歷史，積累了大量文獻(xiàn)、工具和研究資源。同時(shí)粗糙脈胞菌又是一個(gè)天然的纖維素快速降解菌，在干枯的樹干上或禾本科草類的莖桿上，經(jīng)?？梢苑蛛x到。纖維素降解能力很強(qiáng)。以 2%晶體纖維素 Avicel為唯一碳源，粗糙脈孢菌在 4 d內(nèi)就可以將其全部降解，而木霉生長(zhǎng)速度顯著慢于粗糙脈孢菌，降解同樣的纖維素約需要作用7 d。比較里氏木霉實(shí)驗(yàn)室菌株QM9414與粗糙脈孢菌野生型FGSC2489的產(chǎn)酶能力發(fā)現(xiàn)，前4天，粗糙脈孢菌顯著高于木霉，但隨后木霉會(huì)趕超，但二者產(chǎn)酶差別并不大，最終產(chǎn)酶量差異不到 1.5倍[17]。粗糙脈孢菌纖維素酶的研究可以追溯到50年前，1954年，丹麥科學(xué)家Hirsch發(fā)現(xiàn)在濾紙作為唯一碳源的粗糙脈孢菌培養(yǎng)液中檢測(cè)到了相當(dāng)高的還原糖，可達(dá)到0.84 mg/mL[18]。隨后，Eberhart 等對(duì)粗糙脈孢菌纖維素酶進(jìn)行了較為系統(tǒng)地研究，分別研究了 β-葡糖糖苷酶及粗糙脈孢菌纖維素酶調(diào)控[19-21]。1995年，粗糙脈孢菌纖維素外切酶1 (CBH1) 被克隆測(cè)序[22]。作為第一個(gè)被測(cè)序的真菌，2003年粗糙脈孢菌基因組數(shù)據(jù)公布。伴隨粗糙脈孢菌基因組的發(fā)布，有5篇分析粗糙脈孢菌基因組的文章發(fā)表，包括 2篇 Nature雜志文章[23-27]。而隨后美國(guó) NIH啟動(dòng)粗糙脈孢菌功能基因組計(jì)劃(2004?2012) 更是讓這一模式真菌的研究再攀高峰，該項(xiàng)目分4個(gè)專題。專題1是全基因組范圍基因敲除突變體 (Knock out) 的構(gòu)建，截至到目前為止，已經(jīng)有 7 384個(gè)基因的敲除菌株釋放在公共菌種庫(kù) FGSC (Fungal Genetics Stock Center，USA)，包括多數(shù)的木質(zhì)纖維素降解相關(guān)基因，如CBH1 (FGSC 15630)、CBH2 (FGSC 15633) 等。專題2是基因組整合數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建，由麻省理工的 Broad研究所完成，目前數(shù)據(jù)庫(kù)中涵蓋各類基因注釋數(shù)據(jù)，是非常好的一個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)。專題 3由加州大學(xué)伯克利校區(qū)Louise Glass 實(shí)驗(yàn)室承擔(dān)，研制脈孢菌全基因組基因芯片和分析其轉(zhuǎn)錄組。基因芯片已經(jīng)于2007年研制成功[28]。利用該芯片已經(jīng)有53個(gè)轉(zhuǎn)錄組分析完成并投放在絲狀真菌基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫(kù) (www.yale.edu/townsend)[29]。專題4為SNP和表觀遺傳學(xué)研究。由于粗糙脈孢菌具有非常雄厚的研究資源和快速的纖維素降解能力，是研究生物質(zhì)糖代謝分子基礎(chǔ)、木質(zhì)纖維素降解機(jī)理的理想菌種。

粗糙脈孢菌在纖維素降解機(jī)理研究中有得天獨(dú)厚的研究資源和很好的前期功能基因組學(xué)研究基礎(chǔ)。當(dāng)以芒草Miscanthus秸稈為唯一碳源培養(yǎng)N. crassa時(shí)，轉(zhuǎn)錄組分析顯示至少有769個(gè)基因表達(dá)水平與蔗糖培養(yǎng)基相比有顯著差異，其中231個(gè)顯著性地被芒草生物質(zhì)快速誘導(dǎo)上調(diào)，包括19個(gè)纖維素酶基因，14個(gè)半纖維素酶基因，7個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，10個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和大約100個(gè)未知功能基因。其中CBH1上調(diào)426倍，CBH2上調(diào)230倍。當(dāng)比較微晶纖維素 (Avicel) 和蔗糖培養(yǎng)液的轉(zhuǎn)錄組時(shí)，至少有187個(gè)基因顯著被纖維素誘導(dǎo)上調(diào)，其中 CBH1上調(diào)382倍，CBH2上調(diào) 251倍。這些都為下一步通過基因工程、代謝工程獲得新一代纖維素酶系和實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)資源提供了新的基因靶點(diǎn)。在粗糙脈孢菌基因組中，含有7個(gè)類纖維素外切酶 (CBH-like) 基因。16個(gè)內(nèi)切酶 (Endoglucanases) 基因中包括 14個(gè)GH61家族蛋白。80%以上預(yù)測(cè)的纖維素酶都有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和分泌蛋白組數(shù)據(jù)予以支持[17]。N. crassa生長(zhǎng)在芒草和晶體纖維素培養(yǎng)液中時(shí)，至少有50個(gè)分泌蛋白被鑒定。其中包括預(yù)測(cè)的 23種N. crassa纖維素酶中的10種。對(duì)16個(gè)同時(shí)有轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和蛋白質(zhì)譜數(shù)據(jù)支持的基因敲除突變體分析顯示，敲除 CBH1，纖維素降解能力顯著降低；敲除 CBH2纖維素降解能力有所下降，但不如CBH1突變體明顯，這與里氏木霉不同，里氏木霉CBH2突變體表型要明顯強(qiáng)于CBH1[30]。說明粗糙脈孢菌CBH的功能與木霉中的CBH分工可能有所不同，CBH1在粗糙脈孢菌中更加重要，而CBH2在木霉中較為重要，與之一致的是，有人認(rèn)為，在木霉中，CBH2的產(chǎn)物可能有纖維二糖，而纖維二糖可能作為纖維素酶誘導(dǎo)物之一[31]。粗糙脈孢菌基因組有14個(gè)GH61纖維素內(nèi)切酶基因，其中10個(gè)基因得到轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)驗(yàn)證，而且 GH61已經(jīng)被證實(shí)是一類重要的纖維素酶，但里氏木霉只有3個(gè)GH61[15,32]。諾維信最新專利數(shù)據(jù)顯示，向木霉纖維素酶系中添加Thielavia terrestrisGH61酶蛋白，在達(dá)到相同糖化率的條件下，顯著降低加酶量[33]。

發(fā)表在2010年9月9日Science在線快遞關(guān)于粗糙脈孢菌纖維二糖、寡糖特異轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 CDT1、CDT2功能研究及其在纖維素乙醇發(fā)酵上的應(yīng)用研究，是近期生物質(zhì)能源研究的新進(jìn)展[34]。該研究顯示，將粗糙脈孢菌CDT1、CDT2轉(zhuǎn)入釀酒酵母，使原本不能利用纖維二糖的酵母可以利用纖維二糖發(fā)酵生產(chǎn)乙醇，這樣直接發(fā)酵纖維二糖，可以節(jié)約能量，提高纖維素全糖發(fā)酵效率以及對(duì)緩解纖維素酶的反饋抑制有所幫助，為實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)燃料生產(chǎn)提供了新思路。

1.5 其他真菌

除了以上討論的真菌以外，青霉菌Penicillium，嗜熱側(cè)孢霉Sporotrichum thermophile等也進(jìn)入科學(xué)家視野，利用各類組學(xué)技術(shù)，進(jìn)行纖維素降解機(jī)理和應(yīng)用研究。山東大學(xué)微生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離出了一株產(chǎn)酶較高的斜臥青霉P. decumbens，探索通過基因組重排來提高酶的產(chǎn)量[35]，目前正在對(duì)其進(jìn)行全基因組測(cè)序和其他功能基因組學(xué)研究。嗜熱側(cè)孢霉的已有研究也表明[36]，其纖維素酶也有自己的特點(diǎn)，比如耐高溫，但由于研究工具和遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的缺乏，研究目前還處在初步階段。

2 小結(jié)與展望

真菌生物質(zhì)分解代謝途徑如圖 1[17]所示，分為誘導(dǎo)和利用兩個(gè)階段。在誘導(dǎo)階段，微生物感受木質(zhì)纖維素底物存在，用自身基線水平的木質(zhì)纖維素水解酶類降解少許底物，產(chǎn)生信號(hào)分子，誘導(dǎo)木質(zhì)纖維素酶系基因大量表達(dá)。在經(jīng)過一段時(shí)間的大量表達(dá)之后，進(jìn)入利用階段，纖維素酶系的表達(dá)放緩，但仍然維持較高水平的表達(dá)；糖轉(zhuǎn)運(yùn)及隨后代謝相關(guān)基因大量表達(dá)，持續(xù)完成木質(zhì)纖維素降解和隨后的糖代謝。這一模型仍有許多內(nèi)容有待充實(shí)，比如微生物是如何感知木質(zhì)纖維素存在及不同真菌感受的信號(hào)分子是什么，各類纖維素酶的表達(dá)調(diào)控機(jī)制，分泌途徑的調(diào)控等。

木質(zhì)纖維素降解途徑雖然取得了很大進(jìn)展，但離徹底闡釋整個(gè)途徑還有很多路要走。利用功能基因組學(xué)工具，可以在發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因和調(diào)控節(jié)點(diǎn)上快速進(jìn)步，但纖維素酶系之間的協(xié)同作用機(jī)制，以及蛋白質(zhì)分子是如何結(jié)合木質(zhì)纖維素并將之降解的分子機(jī)理及整個(gè)系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)理闡釋都不是一日之功。必須持之以恒地進(jìn)行研究，包括從遺傳學(xué)、酶學(xué)、生物物理等各方面進(jìn)行深入探討，在不斷地解析新機(jī)制，積累新知識(shí)的基礎(chǔ)上，結(jié)合各類基因工程、代謝工程來重構(gòu)木質(zhì)纖維素降解酶系、菌系，發(fā)展出一整套快速經(jīng)濟(jì)的木質(zhì)纖維素酶解體系，為真正實(shí)現(xiàn)生物質(zhì)的全面利用提供知識(shí)和物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 真菌生物質(zhì)糖代謝途徑模式圖[17]Fig.1 The model of lignocellulose degradation by fungi[17].

而在眾多的木質(zhì)纖維素降解微生物中，粗糙脈孢菌是作為纖維素降解機(jī)理研究的理想模式菌，因此深入開展粗糙脈孢菌木質(zhì)纖維素降解的分子機(jī)理研究，對(duì)揭示真菌生物質(zhì)降解途徑，闡釋生物質(zhì)糖代謝的分子基礎(chǔ)和新一代纖維素酶系的重構(gòu)具有重要意義，我們將圍繞 973項(xiàng)目“生物煉制細(xì)胞工廠的科學(xué)基礎(chǔ)”的科學(xué)問題“生物質(zhì)糖代謝的分子基礎(chǔ)”，繼續(xù)利用粗糙脈孢菌體系，結(jié)合功能基因組學(xué)、遺傳學(xué)和生物化學(xué)工具，對(duì)真菌降解纖維素分子機(jī)理和生物質(zhì)糖代謝途徑展開研究，為早日實(shí)現(xiàn)木質(zhì)纖維素的生物煉制作出貢獻(xiàn)。

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Progress in lignocellulose deconstruction by fungi

Chaoguang Tian1, and Yanhe Ma2

1Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin300308,China
2State Key laboratory of Microbial Resources,Institute of Microbiology,Chinese Academy of Sciences,Beijing100101,China

Received:May 27, 2010;Accepted:July 12, 2010

Supported by:National Basic Research Program of China (973 Program) (No. 2007CB707801), One Hundred Person Project of the Chinese Academy of Sciences.

Corresponding author:Chaoguang Tian. Tel: +86-22-84861947; Fax: +86-22-84861948; E-mail: tian_cg@tib.cas.cn

國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707801)，中國(guó)科學(xué)院百人計(jì)劃項(xiàng)目資助。