楊俊杰，范文超，肖晗，關(guān)春鴻，曹傳增,，邵海峰，姜衛(wèi)紅，楊晟,

1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

3 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心，湖州 313000

4 浙江順風(fēng)海德?tīng)栍邢薰?，東陽(yáng) 322100

細(xì)胞工廠的構(gòu)建技術(shù)

枯草芽胞桿菌基因組混組方法

楊俊杰1,2，范文超3，肖晗1，關(guān)春鴻1，曹傳增1,3，邵海峰4，姜衛(wèi)紅1，楊晟1,2,3

1 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院植物生理生態(tài)研究所 合成生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032

2 上海工業(yè)生物技術(shù)研發(fā)中心，上海 201201

3 中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院湖州工業(yè)生物技術(shù)中心，湖州 313000

4 浙江順風(fēng)海德?tīng)栍邢薰?，東陽(yáng) 322100

基因組混組作為一種育種方法，通過(guò)循環(huán)原生質(zhì)體融合等手段，使得不同菌株來(lái)源的基因組能夠得到充分重組，增加將正向突變整合到同一重組子中的機(jī)會(huì)。使用4株帶有4種不同標(biāo)記的枯草芽胞桿菌親本為初始菌株，通過(guò)循環(huán)轉(zhuǎn)化、循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)或循環(huán)原生質(zhì)體融合的手段進(jìn)行基因組混組，統(tǒng)計(jì)后代中非親本類型占整個(gè)群體的比例，以衡量基因組混組的效果。分別經(jīng)過(guò) 5輪循環(huán)原生質(zhì)體融合、循環(huán)轉(zhuǎn)化或者循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)，結(jié)果顯示，重組程度較高者在后代群體中的比例較低，帶有4種標(biāo)記的后代未出現(xiàn)，帶有3種標(biāo)記的后代最高分別為4.53×10?4、1.64×10?4、4.47×10?3，明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的天藍(lán)色鏈霉菌中同樣實(shí)驗(yàn)的結(jié)果：帶4種和3種標(biāo)記的后代分別占2.5%、17%。對(duì)比上述實(shí)驗(yàn)的結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的天藍(lán)色鏈霉菌、乳桿菌基因組混組的結(jié)果，并結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬循環(huán)融合過(guò)程，分析后認(rèn)為:要達(dá)到較充分的基因組混組，需要有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞間高頻重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)，重組頻率應(yīng)該不低于10?3～10?2數(shù)量級(jí)。

基因組混組，枯草芽胞桿菌，分子育種，原生質(zhì)體融合，轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)導(dǎo)，計(jì)算機(jī)模擬

Abstract:Genome shuffling methods were explored forBacillus subtilisstrain molecular breeding. Recycling protoplast fusion,recycling transformation and recycling universal transduction were used for genome shuffling inB. subtilis. Four strains with different nutrition-deficiency markers were used as initial strains. After five rounds protoplast fusion, transformation or transduction,the descendant with 4 markers had not been detected, and the rate of descendant with 3 markers were 4.53×10?4, 1.64×10?4,4.47×10?3, respectively. A computer program was made to simulate the recycling fusion process. Based on simulation result andcomparing the genome shuffling result ofB. subtilisin this experiment and that ofStreptomyces coelicolorreported in references,effective genome shuffling needs a high recombination rate of at least between 10?3and 10?2.

Keywords:genome shuffling,Bacillus subtilis, molecular breeding, protoplast fusion, transformation, transduction,in silicosimulation

優(yōu)良菌種選育是發(fā)酵工程的核心技術(shù)。傳統(tǒng)的手段有誘變育種和雜交育種。常規(guī)的誘變育種方法是以紫外線、輻射或化學(xué)誘變劑處理微生物，產(chǎn)生大量突變，再以所需指標(biāo)進(jìn)行篩選。由于負(fù)突變的比例非常高，一般要篩選 105以上突變體才能得到一個(gè)正突變[1]。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期誘變獲得的菌株在特定性狀有所改善的同時(shí)，一般積累很多有害突變，比如生長(zhǎng)條件要求變苛刻、生存能力變差、細(xì)胞變“脆弱”等。雜交育種選用已知性狀的供體和受體菌種作為親本，結(jié)果大多可以獲得優(yōu)于親本菌株的后代菌株。利用雜交育種往往還可消除誘變獲得的菌株所帶的缺陷[1]。

基因組混組 (Genome shuf fl ing) 是在雜交育種的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的新育種方法。首先通過(guò)經(jīng)典的誘變育種等方法獲得多個(gè)得到改良的菌株，而后通過(guò)循環(huán)原生質(zhì)體融合等手段，使得不同菌株來(lái)源的基因組能夠得到充分重組，增加將正向突變整合到同一重組子中的機(jī)會(huì)，同時(shí)，積累的有害突變可被其他菌株的野生型序列所代替。希望最終可以獲得一批性能改良的重組子。這種思路最初是從 DNA 混組(DNA shuf fl ing) 中的退火步驟得到啟發(fā)，對(duì)原生質(zhì)體融合育種技術(shù)作了改進(jìn)，將融合后的菌株不經(jīng)篩選就進(jìn)行下一輪融合，經(jīng)過(guò)這樣反復(fù)多次的操作以后才進(jìn)行篩選，從而使得再生菌落的基因組重組程度大幅度提高。

基因組混組的用于微生物育種過(guò)程，其具體操作過(guò)程分為 3個(gè)步驟[2]。第一步是建立用于混組的初始群體。如果初始群體不好，那么無(wú)論后面的步驟做得如何，最終也將難以獲得具有預(yù)期性狀的后代。初始群體的獲得，可以使用傳統(tǒng)育種的方法，比如通過(guò)傳統(tǒng)誘變篩選等技術(shù)獲得一批性狀有所改善的初始菌株。野生型菌株或者代謝工程改造獲得的菌株，也可能作為混組初始群體的成員[3]。第二步，使用原生質(zhì)體融合等技術(shù)手段，使初始群體中多個(gè)親本基因組之間發(fā)生充分的交換和重組。常規(guī)單輪原生質(zhì)體融合用于 2個(gè)親本間的基因組交換重組較為有效，但是融合過(guò)程中多個(gè)細(xì)胞碰撞到一起融合的概率較低。為了實(shí)現(xiàn)多親本基因組之間的交換重組，引入了循環(huán)原生質(zhì)體融合的手段。即多個(gè)初始群體中多種類型的親本細(xì)胞同時(shí)制備原生質(zhì)體，混合后進(jìn)行一輪融合；而后收集融合后獲得的后代再生細(xì)胞，作為一個(gè)群體進(jìn)行培養(yǎng)。而后制備原生質(zhì)體，進(jìn)行新一輪融合。融合過(guò)程重復(fù)多輪。第三步，使用特定的篩選方法將具有期望性狀的后代細(xì)胞篩選出來(lái)。這一步需要根據(jù)育種具體目的采取相應(yīng)的方案。循環(huán)融合獲得的后代細(xì)胞庫(kù)可能非常大，此時(shí)需要有相應(yīng)的高通量篩選手段以便從中篩選到具有更好性狀者[1]。

2002年Zhang等首次應(yīng)用基因組混組技術(shù)提高弗氏鏈霉菌Streptomyces fradiae的泰樂(lè)菌素產(chǎn)量。經(jīng)1次誘變育種加上2輪基因組混組，歷時(shí)1年，得到了2株高產(chǎn)菌株GS1和GS2，其生產(chǎn)能力和通過(guò)傳統(tǒng)誘變技術(shù)獲得的高產(chǎn)菌 SF21的生產(chǎn)能力相當(dāng)。而SF21的獲得歷經(jīng)20輪誘變、歷時(shí)20年[4]。同一年，Patnaik等通過(guò)基因組混組提高乳桿菌Lactobacillussp.耐酸性，經(jīng)5輪循環(huán)融合后，篩選得到的新菌株可以在出發(fā)株不能生長(zhǎng)的酸性環(huán)境pH 3.5條件下生長(zhǎng)。同時(shí)，在pH 4.0的條件下該菌株的乳酸產(chǎn)量比野生型菌株提高了3倍[5]。如文獻(xiàn)[2]所綜述，近幾年來(lái)又有了較多的關(guān)于此種技術(shù)應(yīng)用的報(bào)道。

基因組混組在芽胞桿菌中的應(yīng)用有以下一些報(bào)道。梁惠儀等以具有纖溶酶活性的枯草芽胞桿菌DC-12為初始菌株，首先通過(guò)進(jìn)行紫外誘變和亞硝酸誘變。而后選取 4株誘變菌株作為直接親本，采用電融合的方法進(jìn)行 2次多親本的基因組混組，共篩選出 2株酶活大大提高并能穩(wěn)定遺傳的菌株，酶活提高了 4～5倍[6]。陳亮等首先對(duì)枯草芽胞桿菌BS14進(jìn)行誘變，而后使用獲得3株菌UV22-5、HN8-7和HN18-3為初始菌株進(jìn)行了3輪基因組混組，獲得了1株穩(wěn)定菌株F35。F35對(duì)真菌尖孢鐮刀菌甜瓜專化型Fusarium oxysporumf. sp.melonis的抗性比 HN8-7和 BS14分別提高了 34.52%和65.48%[7]。

在芽胞桿菌中，尚沒(méi)有報(bào)道對(duì)于多輪融合后基因組混組的效果進(jìn)行較系統(tǒng)的研究。本研究以枯草芽胞桿菌為材料，研究了多輪融合過(guò)程中基因組混組程度的改變。除此之外，也將循環(huán)轉(zhuǎn)化和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這2種手段引入基因組混組的工作，探索了多輪轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中，基因組混組程度的改變。根據(jù)這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬循環(huán)融合過(guò)程，推斷要達(dá)到高效的基因組混組，需要有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞以較高頻率獲得重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

培養(yǎng)基使用 LB、TB、SOC培養(yǎng)基?？股貪舛确謩e為氨芐青霉素100 mg/L、壯觀霉素50 mg/L、卡那霉素50 mg/L、氯霉素5 mg/L。所用的其他材料為常規(guī)材料。

1.2 菌株、質(zhì)粒和噬菌體

本研究中構(gòu)建和使用的質(zhì)粒見(jiàn)表1。

構(gòu)建的枯草芽胞桿菌菌株和噬菌體見(jiàn)表 2。本研究中部分菌株構(gòu)建過(guò)程如圖1所示，具體如下：

表1 本研究中使用或構(gòu)建的質(zhì)粒Table 1 Plasmids used in this study

表2 本研究中使用或構(gòu)建的菌株和噬菌體株Table 2 Strains used in this study

圖1 本研究中枯草芽胞桿菌菌株構(gòu)建過(guò)程Fig.1 Constructinon ofBacillus subtilisstrains.

用整合載體pSG1190轉(zhuǎn)化QB917 (hisA1，thr5，trpC2)，在 QB917基因組上的 amyE基因的位置上插入一個(gè)壯觀霉素抗性基因，得到 MMF1(hisA1，thr5，trpC2，SpcR)。以 QB944(purA16，cysA14，trpC2)作為 DNA供體，MMF1作為受體，獲得 MMF2(purA16，thr5，trpC2，SpcR)。

以原養(yǎng)型 SB491作為 DNA供體，以 QB934(tre12，metC3，glyB133，trpC2) 作為受體菌，轉(zhuǎn)化得到 MMF3 (metC3)。用 PCR方法把 MMF3中的metC3基因緊鄰下游的基因擴(kuò)增出來(lái)，克隆到整合載體pBGSC6中，得到pBGSC6M。用pBGSC6M轉(zhuǎn)化MMF3,得到MMF4 (metC3，CmR)。以 MMF4作為DNA供體，MMF2作為受體菌，分別以不同條件篩選轉(zhuǎn)化子，并對(duì)獲得的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定。最終獲得 4株菌株，分別是：MMF5 (purA16，thr5，trpC2)，MMF6 (purA16，metC3，trpC2)，MMF7 (thr5，metC3，trpC2)，MMF8 (purA16，thr5，metC3)。

1.3 循環(huán)融合

取MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過(guò)夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計(jì)作為F0。

將F0群體制備原生質(zhì)體，加入PEG 以介導(dǎo)融合，涂布于非選擇性的再生平板。將再生平板上獲得的全部菌落以無(wú)菌水洗下，獲得的菌體懸液為F1。同樣的，以F1群體制備原生質(zhì)體并進(jìn)行融合，獲得的下一代群體定義為F2。以后各代依次為F3、F4、F5。具體過(guò)程如圖2所示。

取各代梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算它們?cè)谌后w中所占的比例。

原生質(zhì)體的制備和PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體融合的具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道，高滲溶液使用SMMP + BSA，再生培養(yǎng)基使用DM3培養(yǎng)基。

圖2 3種技術(shù)手段進(jìn)行基因組混組示意圖Fig.2 Perform genome shuffling by recycling protoplast fusion, transformation or transduction.

1.4 循環(huán)轉(zhuǎn)化

和 1.3節(jié)一樣，取MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過(guò)夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計(jì)作為F0。抽提F0群體的基因組，并且轉(zhuǎn)化F0群體的感受態(tài)細(xì)胞，獲得的下一代群體定義為F1。同樣，基因組轉(zhuǎn)化F1，獲得的下一代群體定義為F2。以后各代的依次為 F3、F4、F5。具體過(guò)程如圖 2所示。

取各代細(xì)胞梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算在群體中所占的比例。

為了確定每一批的感受態(tài)轉(zhuǎn)化效率與基因組制備質(zhì)量，引入了輔助菌株 FW7E。每一代進(jìn)行過(guò)程中，F(xiàn)W7E基因組轉(zhuǎn)化Fn (Fn代表F0、F1……)，用于檢驗(yàn)感受態(tài)效率；同時(shí)，使用 Fn 基因組轉(zhuǎn)化FW7E，用于檢驗(yàn)基因組抽提質(zhì)量。

抽提基因組與制備感受態(tài)的具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道。

1.5 循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)

和1.3節(jié)一樣，取 MMF5、MMF6、MMF7、MMF8的過(guò)夜培養(yǎng)物，等比例混合作為初始群體，計(jì)作為F0。

將F0群體的一部分用噬菌體PBS1感染，制備裂解液。裂解液感染F0群體，獲得的下一代群體定義為 F1。同樣地，以 F1群體制備噬菌體裂解液感染 F1群體，獲得的下一代群體定義為 F2。以后各代的依次為F3、F4、F5。具體過(guò)程如圖2所示。

取各代梯度稀釋后涂布于添加不同氨基酸或堿基的基本培養(yǎng)基，計(jì)數(shù)各代中各種基因型細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算它們?cè)谡麄€(gè)群體中所占的比例。

轉(zhuǎn)導(dǎo)的具體實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[13]報(bào)道。

1.6 循環(huán)融合過(guò)程的電子模擬

編制程序，模擬含有 108個(gè)細(xì)胞的群體，以不同的重組頻率，經(jīng)過(guò) 5輪融合后，后代中各種基因型的所占比例的變化。

模擬過(guò)程使用窮舉算法。以重組頻率10%為例對(duì)算法進(jìn)行具體說(shuō)明：首先取出一個(gè)細(xì)胞，根據(jù)初始比例得到其基因型。有10%可能性這個(gè)細(xì)胞參加了融合和重組，則根據(jù)親本基因型確定融合子基因型，計(jì)算產(chǎn)生下一代的細(xì)胞。剩余90%可能性，這個(gè)細(xì)胞在本輪融合過(guò)程中沒(méi)有參加重組，即可能沒(méi)有參加融合，保持親本類型；也可能細(xì)胞暫時(shí)融合后，形成異核體，而后基因組沒(méi)有進(jìn)行重組而迅速分離成親本類型，那么又按照其基因型不變，產(chǎn)生下一代的細(xì)胞。每一輪融合模擬計(jì)算 108個(gè)細(xì)胞，產(chǎn)生108個(gè)后代細(xì)胞。共模擬計(jì)算5輪。

FORTRAN95程序源代碼如附錄。使用ThinkPad T400 硬件系統(tǒng)，UBUNTU8.10、GFORTRAN 7.4軟件系統(tǒng)，不同的重組頻率參數(shù)下，分別重復(fù)運(yùn)行 4次，取平均值。記錄模擬的結(jié)果，并與實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行對(duì)比分析。

2 結(jié)果

2.1 進(jìn)行基因組混組的初始菌株

本實(shí)驗(yàn)首先獲得的4株帶有3缺陷的菌株，即MMF5、MMF6、MMF7、MMF8。對(duì)于purA16、thr5、metC3、trpC2 這4個(gè)位點(diǎn)，上述每一菌株分別帶有1個(gè)原養(yǎng)型標(biāo)記、3個(gè)缺陷型標(biāo)記：MMF5 (purA16，thr5，trpC2，MetC3+)、MMF6 (purA16，metC3，trpC2，Thr5+)、MMF7 (thr5，metC3，trpC2，PurA16+)、MMF8 (purA16，thr5，metC3，TrpC2+)，其中粗體且首字母大寫(xiě)的為原養(yǎng)型正標(biāo)記。

這些標(biāo)記在基因組上的位置如圖 3所示；從上面的正標(biāo)記的位置圖可以看出來(lái)，4個(gè)標(biāo)記在基因組上分布均勻。通過(guò)鑒定這4個(gè)菌株的后代群體中，帶有2個(gè)或2個(gè)以上原養(yǎng)型正標(biāo)記的個(gè)體的數(shù)量和所占的比例，可以比較基因組混組的效率。

2.2 原生質(zhì)體的制備、再生與融合

經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)條件摸索，確定了原生質(zhì)體的制備、再生與融合的具體方案和參數(shù)。維持原生質(zhì)體穩(wěn)定的等滲溶液使用 SMMP (+BSA)。主要穩(wěn)定劑是蔗糖，緩沖體系是磷酸鹽和順丁烯二酸鹽，BSA用于提高再生率。溶菌酶濃度為2 mg/mL，37℃～39℃處理1～2 h，鏡檢觀察至沒(méi)有桿菌殘留時(shí)停止溶菌酶處理。再生培養(yǎng)基選用DM3培養(yǎng)基，主要穩(wěn)定劑和緩沖體系是丁二酸鹽。融合方法使用PEG法，處理?xiàng)l件為40% PEG6000 冰浴1～2 min。

經(jīng)多次重復(fù)，原生質(zhì)體形成率，即原生質(zhì)體數(shù)/(原生質(zhì)體數(shù)+剩余桿菌數(shù))，一般大于99.9%；原生質(zhì)體再生率，即 (再生菌數(shù)?剩余桿菌數(shù))/(細(xì)胞總數(shù)?剩余桿菌數(shù))，為10%左右；單次融合過(guò)程中重組頻率，即后代群體中重組體總數(shù)/后代群體總數(shù)，在10?5左右。這些都符合文獻(xiàn)[14]報(bào)道。

圖3purA16、thr5、metC3、trpC2 4個(gè)基因枯草芽胞桿菌在染色體上的位置Fig.3 Positions ofpurA16,thr5,metC3 andtrpC2onBacillus subtilischromosome.

2.3 循環(huán)融合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

循環(huán)融合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表 3。從中可以看出，經(jīng)過(guò)5輪轉(zhuǎn)化，其中同時(shí)帶有4個(gè)標(biāo)記的融合子沒(méi)有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個(gè)和2個(gè)標(biāo)記的后代，總體上有增加的趨勢(shì)。

表3 五輪循環(huán)融合過(guò)程中各類型枯草芽胞桿菌后代的數(shù)量以及在群體中所占的比例Table 3 Counts and rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five rounds protoplast fusion

2.4 電子模擬循環(huán)融合過(guò)程的結(jié)果

分別把重組頻率設(shè)定為 10?5、10?4、10?3、10?2、10?1作為參數(shù)，運(yùn)行模擬程序。模擬 5輪融合后，含有多個(gè)標(biāo)記的細(xì)胞在后代群體中所占的比例如表4所示。

對(duì)比實(shí)驗(yàn)結(jié)果和模擬結(jié)果。天藍(lán)色鏈霉菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和重組頻率 10?1的模擬結(jié)果相互對(duì)應(yīng)，帶 4個(gè)標(biāo)記的后代4到五輪融合后達(dá)到10?2數(shù)量級(jí)?？莶菅堪麠U菌的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和重組頻率10?4左右的模擬結(jié)果相互對(duì)應(yīng)。帶4個(gè)標(biāo)記的后代5輪融合后沒(méi)有出現(xiàn)，帶有 3個(gè)標(biāo)記出現(xiàn)但比例不高。考慮到生長(zhǎng)過(guò)程中帶有更多個(gè)原養(yǎng)型標(biāo)記基因的后代會(huì)略有優(yōu)勢(shì)。電子模擬過(guò)程基本上符合了實(shí)際的情況。

表 4 模擬不同重組頻率下五輪融合后各類型枯草芽胞桿菌后代在群體中所占的比例Table 4 Rates of descendant with 2,3 and 4 markers after five rounds simulation protoplast fusion

表 5 天藍(lán)色鏈霉菌和枯草芽胞桿菌循環(huán)融合實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較Table 5 Comparison of the result of cycling protoplast fusion ofB. subitilisandS. colicolor

2.5 轉(zhuǎn)化效率與轉(zhuǎn)化頻率

經(jīng)過(guò)多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)中，單次轉(zhuǎn)化過(guò)程中重組頻率基本可以保證在10?3數(shù)量級(jí)，也符合文獻(xiàn)[15]報(bào)道。

2.6 循環(huán)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

循環(huán)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表 6。從中可以看出，經(jīng)過(guò)5輪轉(zhuǎn)化，其中同時(shí)帶有4個(gè)標(biāo)記的轉(zhuǎn)化子沒(méi)有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個(gè)和2個(gè)標(biāo)記的后代，總體上處于增加的趨勢(shì)。

2.7 噬菌體效價(jià)和轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率

裂解液效價(jià)在108PFU/mL以上。單次轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中重組頻率 7.0×10?7～2.0×10?6之間，符合文獻(xiàn)[15]報(bào)道。

2.8 循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

循環(huán)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果見(jiàn)表 7。從中可以看出，經(jīng)過(guò)五輪轉(zhuǎn)導(dǎo)，其中同時(shí)帶有4個(gè)標(biāo)記的轉(zhuǎn)導(dǎo)子沒(méi)有穩(wěn)定出現(xiàn)。帶有3個(gè)和2個(gè)標(biāo)記的后代，總體上處于增加的趨勢(shì)。

表6 五輪循環(huán)轉(zhuǎn)化過(guò)程中各類型枯草芽胞桿菌后代的數(shù)量以及在群體中所占的比例Table 6 Counts and Rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five founds transformation

表7 五輪循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中各類型枯草芽胞桿菌后代在群體中所占的比例Table 7 Counts and rates of descendant with 2, 3 and 4 markers in five rounds transduction

3 討論

據(jù)報(bào)道，使用4株帶有4個(gè)不同標(biāo)記基因的天藍(lán)色鏈霉菌S. coelicolor為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行基因組混組實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)4輪原生質(zhì)體融合，帶有4個(gè)標(biāo)記基因的后代在群體中的比例達(dá)到了 2.5%，帶有 3個(gè)和2個(gè)遺傳標(biāo)記的后代所占的比例分別到達(dá)17%和60%[4]。根據(jù)本研究的結(jié)果，使用枯草芽胞桿菌做相同的實(shí)驗(yàn)，經(jīng)過(guò)5輪原生質(zhì)體融合，帶有4個(gè)標(biāo)記的后代沒(méi)有出現(xiàn)。在3輪融合后帶有3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代開(kāi)始出現(xiàn)。5輪后帶有 3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代最終比例是 10?5，帶有 2個(gè)遺傳標(biāo)記的后代所占的比例也在10?3數(shù)量級(jí)。

究其原因，在于各種微生物細(xì)胞重組頻率差別很大。天藍(lán)色鏈霉菌融合過(guò)程中重組頻率在10?1數(shù)量級(jí)，最高達(dá)到17%。鏈霉菌循環(huán)融合實(shí)驗(yàn)中，第1輪融合后，重組子比率達(dá)到8.4%[4]。這樣，前一輪融合獲得的重組子，有很大機(jī)會(huì)參加第 2輪融合而產(chǎn)生新的重組子。因此，4輪融合后的群體中，高達(dá)80% 的成員是經(jīng)過(guò)基因重組的。其中2.5%是充分重組的后代，即帶有來(lái)自4個(gè)不同親本的4個(gè)不同的遺傳標(biāo)記。另外的報(bào)道中，使用通過(guò)基因組混組的方法提高了乳桿菌的耐酸性能，其每輪融合的重組頻率為0.1%～1%[5]。而枯草芽胞桿菌原生質(zhì)體融合過(guò)程中重組頻率在 10?5的數(shù)量級(jí)，明顯低于上述二者。常規(guī)單輪融合后，重組的后代在后代群體中所占的比例很少，群體中的絕大多數(shù)成員仍然是親本類型。多輪融合過(guò)程中，重組的后代參加后一次融合獲得再次重組的機(jī)會(huì)很低。

循環(huán)融合的電子模擬結(jié)果同樣印證了這一點(diǎn)。單輪的重組頻率差一個(gè)數(shù)量級(jí)，帶有3個(gè)或者4個(gè)標(biāo)記的后代在多輪融合后所占的比例，就會(huì)差 2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。因此，要達(dá)到充分的基因組混組，需要一種有能夠?qū)崿F(xiàn)微生物細(xì)胞間高頻重組的操作技術(shù)作為基礎(chǔ)：循環(huán)融合中，不低于10?3～10?2的重組頻率應(yīng)該是進(jìn)行有效混組的技術(shù)基礎(chǔ)。否則重組頻率較高的后代在群體中所占的頻率將會(huì)很低，從中篩到具有優(yōu)良性狀的后代會(huì)較為困難。

同時(shí)，本研究中引入了循環(huán)融合和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這兩種技術(shù)手段進(jìn)行基因組混組。從循環(huán)轉(zhuǎn)化的結(jié)果來(lái)看，單輪轉(zhuǎn)化后除了產(chǎn)生帶有 2個(gè)遺傳標(biāo)記的后代外，同時(shí)也產(chǎn)生了帶有 3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代。解釋為只要發(fā)生共轉(zhuǎn)化事件，即可實(shí)現(xiàn) 3個(gè)遺傳標(biāo)記集中于一個(gè)后代細(xì)胞。經(jīng)過(guò)多輪轉(zhuǎn)化后，重組細(xì)胞有所增加，3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代在10?4數(shù)量級(jí)。循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)的結(jié)果和循環(huán)轉(zhuǎn)化的結(jié)果類似，單輪轉(zhuǎn)導(dǎo)即可產(chǎn)生了帶有3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代。多輪轉(zhuǎn)導(dǎo)后，3個(gè)遺傳標(biāo)記的后代也在 10?3數(shù)量級(jí)。其中，轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)果后代所占比例總體上顯示增加的趨勢(shì)，但有一定的波動(dòng)，分析可能的原因是部分細(xì)胞被噬菌體裂解影響到了總菌落計(jì)數(shù)?？偨Y(jié)起來(lái)，循環(huán)融合和循環(huán)轉(zhuǎn)導(dǎo)這兩種技術(shù)手段同樣無(wú)法實(shí)現(xiàn)高效的基因組混組。根據(jù)目前獲得的結(jié)果，尚無(wú)法對(duì)枯草芽胞桿菌 3種技術(shù)手段進(jìn)行基因組混組的優(yōu)劣作出明確的結(jié)論。

如果使用轉(zhuǎn)化或者轉(zhuǎn)導(dǎo)的技術(shù)手段進(jìn)行有效基因組混組，考慮其單輪引入的片段更短，所以對(duì)于轉(zhuǎn)化頻率或轉(zhuǎn)導(dǎo)頻率要求會(huì)比循環(huán)融合更高一些，也不應(yīng)低于 10?3～10?2數(shù)量級(jí)。在關(guān)于多元自動(dòng)化基因組工程 (Mupltiplexautomated genome engineering，MAGE) 技術(shù)的報(bào)道中，每一輪操作中可以使群體中30%以上的細(xì)胞獲得了新的遺傳修飾。由此推而廣之，包括多元自動(dòng)化基因組工程、基因組混組在內(nèi)的多種基因組水平的菌種改造手段，可能都需要有一種技術(shù)手段，保證每一次操作后，群體中獲得修飾的成員在整體中所占的比例達(dá)到一定的水平，最終經(jīng)過(guò)多輪操作后才能得到多樣性較為豐富的突變庫(kù)，最終更容易從中篩選到性狀優(yōu)良的成員。

退一步講，根據(jù)本研究的結(jié)果，多輪實(shí)驗(yàn)操作后，雖然重組子比例較低、基因組混組不充分，但也有一定程度的混組，已經(jīng)出現(xiàn)了帶有 3個(gè)篩選標(biāo)記的后代。如果擴(kuò)大混組群體的規(guī)模，或者增加循環(huán)數(shù)，無(wú)篩選的條件下仍然有可能獲得充分混組、帶有 4個(gè)標(biāo)記的后代。如果后續(xù)有高效篩選方法，可以將群體中較低頻率出現(xiàn)的一些重組子有效地篩選出來(lái)。應(yīng)用于育種的過(guò)程，仍然有可能獲得性能提高的菌株。

如果在枯草桿菌的實(shí)驗(yàn)技術(shù)上有突破，比如重組頻率可以大幅提高，那么多輪操作后基因組混組的效果同樣可以得到提高。原生質(zhì)體滅活法可以有效地提高篩選到優(yōu)良融合子的機(jī)率，并且用于紫杉醇生產(chǎn)菌樹(shù)狀多節(jié)孢菌Nodulisporium sylviform的基因組混組[16]。原生質(zhì)體融合前，首先以不同的方式滅活。滅活的過(guò)程中對(duì)原生質(zhì)體的某些方面造成了一定的損害，使其無(wú)法再生。不同的方法造成的損害是不同的，比如熱滅活主要是蛋白質(zhì)變性，紫外滅活主要是DNA損傷。因此，不同方法滅活后的原生質(zhì)體融合后可以相互互補(bǔ)損害，理論上只有融合子才可以再生。這樣減少了一些篩選工作，提高了篩選到優(yōu)良融合子的機(jī)率。新的融合技術(shù)的引入也可能解決重組頻率低的問(wèn)題。李寰宇[17]和 Gong等[18]使用飛秒激光誘導(dǎo)紅法夫酵母Phaf fi a rhodozyma細(xì)胞融合，重組頻率達(dá)到80%以上。另外，一種新報(bào)道的融合方法是使用微觀流體設(shè)備直接捕獲原生質(zhì)體用于融合[19]。此種方法中用于融合的細(xì)胞是有導(dǎo)向的選擇，因此比其他方法有更高的融合效率。

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1Key Laboratory of Synthetic Biology,Institute of Plant Physiology and Ecology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Shanghai200032,China
2Shanghai Research and Development Center of Industrial Biotechnology,Shanghai201201,China
3Huzhou Research Center of Industrial Biotechnology,Shanghai Institutes for Biological Sciences,Chinese Academy of Sciences,Huzhou
313000,China
4Zhejiang Shunfeng Haider Co. Ltd.,Dongyang322100,China

Received:March 20, 2010;Accepted:June 7, 2010

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 30370022, 30570028), National Basic Research Program of China (973 Program)(No. 2007CB707803).

Corresponding author:Sheng Yang. +86-21-54924173; Fax: +86-21-54924015; E-mail: syang@sibs.ac.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (Nos. 30370022, 30570028)，國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃 (973計(jì)劃) (No. 2007CB707803) 資助。