沈 慶,李 華,蘭四友,蔣幼凡,熊 剛

(1.重慶市第三人民醫(yī)院呼吸內科 400014;2.重慶醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院呼吸內科 400010;3.第三軍醫(yī)大學西南醫(yī)院心胸外科,重慶400038)

α1,3FUCTⅦ是一種糖鏈加工酶,能催化巖藻糖基轉移到糖蛋白糖鏈底物,它是產生Slex(又稱為唾液酸化的路易斯-X)的重要物質,大量文獻報道,Slex在大腸癌、胃癌、膀胱癌等腫瘤組織中呈明顯增強表達[1-3],并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉移和預后密切相關。但α1,3FUCTⅦ與腫瘤轉移的關系尚不十分清楚。本研究應用 RT-PCR法檢測α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌組織、癌旁正常肺組織中的表達,探討α1,3FUCTⅦ基因mRNA的表達與臨床病理因素的關系,以及其在肺癌發(fā)展過程中可能的作用。

1 材料與方法

1.1 標本 收集本院及協(xié)作單位2008年6月至2009年6月期間手術切除肺癌新鮮標本92例(男52例,女40例),患者平均年齡(54±17)歲。其中腺癌36例,鱗癌30例,小細胞癌26例。癌旁正常肺組織選擇遠離癌組織(＞5 cm)的正常支氣管黏膜和肺組織20例作為對照觀察。所有標本投入液氮速凍之后,3 h內轉移至-80℃低溫冰箱凍存。

1.2 試劑 Rever Tre Ace-a-逆轉錄試劑盒購自TOYOBO公司,PCR System 9700購自 Applied Biosy Stems公司,PCR Mix Taq購自天跟公司。

1.3 RT-PCR法 取標本 20～100 mg,以 TRNzol試劑提取總RNA。將2μg RNA置于 10μL逆轉錄反應體系中逆轉錄為cDNA,再行 PCR擴增。根據(jù)已知α1,3FUCT Ⅶ基因序列由上海生物技術有限公司合成引物,上游:5′-CCC CGC AG CAA GTC TAT GA-3′,下游:5′-CCA CCC CTG CTT CCT GAC CT-3′(181 bp)。 GAPDH(內參照)引物上游:5′-TG GGG TGA TGC TGG TGC TGA GT-3′,下游:5′-AG GTT TCT CCA GGCGGC ATG TC-3′(500 bp)。PCR反應條件94℃預變性10 min;94℃變性45 s,63℃退火1 min,72℃延伸1 min。35個循環(huán);72℃終延伸10 min。擴增產物10 g/TBE瓊脂糖凝膠電泳。溴化乙錠顯影,凝膠成像系統(tǒng)(UVITec公司)成像。Image-Pro Plus6.0軟件行半定量分析目的基因的相對表達量以目的條帶積分光密度(IOD)值與內參照條帶IOD值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)處理,所得數(shù)據(jù)以±s表示,兩組均數(shù)的比較采用t檢驗,兩組以上均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

α1,3FUCTⅦ基因mRNA在肺癌組織中的表達(表 1,圖1、2)。α1,3FUCT Ⅶ基因 m RNA在肺癌組織中表達量為(0.67±0.15),在癌旁正常肺組織表達量為(0.45±0.11),差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中在腺癌組織(0.79±0.19)中表達最強,小細胞肺癌組織(0.68±0.17)中表達次之,鱗癌組織中表達(0.51±0.12)最弱,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實驗中發(fā)現(xiàn),α1,3FUCTⅦ基因 mRNA在鱗癌組織中表達與癌旁正常肺組織表達差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。此外,α1,3FUCT Ⅶ基因mRNA表達與年齡、性別無關(P＞0.05)。與TNM分期、分化程度、淋巴結轉移、組織學類型有關(P＜0.05)。

表1 α1,3 FUCTⅦm RNA的表達與肺癌臨床和病理學特征的關系

圖1 α1,3 FUCTⅦmRNA在癌旁正常組織及鱗癌組織中的表達

圖2 α1,3 FUCTⅦmRNA在腺癌組織及小細胞肺癌組織中的表達

3 討 論

FUCT是一類負責將GDP巖藻糖中的巖藻糖基(Fucose)轉移至N-乙酰氨基乳糖單鏈(GlcNAc)上并以α-巖藻糖苷鍵相連接的酶。其主要作用底物是糖蛋白的O-糖或乳糖系、新乳糖系的糖脂,也可以是N-糖鏈,產物主要是含有α-巖藻糖基的血型抗原,如A、B、O血型抗原和 Lewis糖鏈抗原(Le)。FUCTⅦ是巖藻糖基轉移酶(fucosyltransferase,FUCT)的一個亞型,它是Ⅱ類跨膜拓撲結構,N端有14個氨基酸位于細胞質,接著為19個氨基酸的疏水跨膜區(qū)以及位于高爾基體內的309個氨基酸催化結構域。1994年 Sasaki等[4]在 THP-C細胞cDNA文庫中將其克隆出來。其cDNA全長為1.7 kb,開放閱讀框架編碼 342個氨基酸,相對分子質量為39.2×103,基因定位在染色體9q34.3。目前的研究發(fā)現(xiàn),巖藻糖基化參與多種生物學過程,包括組織生長、血管生成、細胞增殖、黏附、侵襲和腫瘤轉移。至少有18種人基因疾病起因于N-糖基化蛋白改變[5-7]。Prorok等[8]的研究顯示:高親和力的選擇素和其配體的相互作用需要core2基礎的0聚糖,它的合成需要巖藻糖轉移酶Ⅶ(FUCTⅦ)和磺基轉移酶,以core1前提為底物進行修飾,最終形成側鏈為 Slex的core2基礎的 0聚糖。而FUCTⅦ及其產物Slex對肝癌細胞H7721的轉移能力起至關重要的作用[9]。

眾所周知,α巖藻糖轉移酶大家族目前已發(fā)現(xiàn)有9種亞型,其中FUCT-Ⅲ(Lewis血型,Le)主要分布在腎、膽囊及乳汁中。FUCT-Ⅳ(類髓型)產物為Lex及ⅥM-2,存在于 5～10周胚胎各組織,在成人僅在髓系組織及大腦中表達。FUCT-Ⅵ(血漿型)主要存在于肝臟和血漿,其產物為Lex和Slex。其中FUCT-Ⅵ催化合成Slex的能力可以是FUCTⅦ的1.5倍[10]。FUCTⅦ(白細胞型)在白細胞中表達,只能以唾液酸化的糖鏈為底物,合成Slex[11]。前期的研究發(fā)現(xiàn),FUCTⅦ的活性可以直接影響Slex的表達量并進而影響肝癌細胞的黏附、趨化性遷移和侵襲等轉移表型[12]。用佛波脂(TPA,一種促癌劑,也是PKC蛋白激酶激活劑)處理Jurkat細胞觀察FUCTⅦ及其產物Slex表達的改變,結果發(fā)現(xiàn)處理后的細胞增加FUCTⅦ的轉錄及其產物Slex的表達,并能誘導合成 E-選擇素配體合成[13]。

本文研究發(fā)現(xiàn),α1,3FUCTⅦ基因m RNA在肺癌組織中表達量明顯高于癌旁正常組織,其中在腺癌組織表現(xiàn)最強。而且α1,3FUCTⅦ基因mRNA表達與 TNM 分期、分化程度、淋巴結轉移、組織學類型有關,與年齡、性別無關。表明α1,3FUCTⅦ基因mRNA表達可能與肺癌的發(fā)生及轉移相關。

然而,本實驗僅限于對肺癌組織標本中α1,3FUCTⅦ基因m RNA進行研究,驗證其與臨床病理因素的關系,至于α1,3FUCTⅦmRNA在肺癌中的作用機制尚未涉及,肺癌組織中的Lewis抗原與α1,3FUCTⅦmRNA關系如何尚不清楚。因此,還需要進一步研究在肺癌組織中Lewis抗原與其合成酶FUCT之間的關系,并結合相關細胞系及臨床結果來證實這種Lewis抗原及相關的糖鏈加工酶是否能成為腫瘤轉移的新的生物學指標和防止腫瘤轉移可能的治療靶點。

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