李 鋮 鋮， 王 際 輝， 王 晗， 葉 淑 紅

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

目前為止，二型糖尿病已經(jīng)發(fā)展成為世界上最流行的代謝疾病之一。導(dǎo)致糖尿病發(fā)生的原因很多，包括環(huán)境因素、遺傳因素和生活習(xí)慣[1]。胰島素抵抗貫穿二型糖尿病的發(fā)生發(fā)展全過(guò)程。針對(duì)胰島素抵抗的研究中，研究者已經(jīng)成功復(fù)制多種胰島素抵抗細(xì)胞模型[2-3]。目前使用的肝細(xì)胞模型大多來(lái)源于人肝癌細(xì)胞(HepG2)，種類單一，也有一些研究表明有些腫瘤細(xì)胞本身也存在著胰島素抵抗[4]。張氏肝細(xì)胞是人永生化正常肝細(xì)胞株,具有人類肝細(xì)胞的特征,其表面表達(dá)高親和力的胰島素受體滿足典型胰島素受體所要求的標(biāo)準(zhǔn),包括葡萄糖的攝取、糖原合成酶的活性、脂類生成及RNA的合成[5]。本文模擬機(jī)體胰島素抵抗的發(fā)病機(jī)制及其病理生理學(xué)特點(diǎn),探討高濃度胰島素體外誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗模型的可能性,為研究胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展機(jī)制及篩選改善胰島素抵抗的藥物提供一種簡(jiǎn)便可靠的胰島素抵抗細(xì)胞模型。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

張氏肝細(xì)胞購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)；RPMI 1640培養(yǎng)液(250 mL培養(yǎng)液中含300 mg/L谷氨酰胺，2 000 mg/L碳酸氫鈉)購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；胎牛血清(FBS)、青霉素和鏈霉素購(gòu)于美國(guó)Gibico公司；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、牛胰島素和胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；葡萄糖測(cè)定試劑盒購(gòu)于上海榮盛生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)于大連沈聯(lián)化學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

張氏肝細(xì)胞復(fù)蘇后用含滅活的15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入玻璃培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下常規(guī)方法培養(yǎng)[5]，每2天換液，每5天用0.25%胰蛋白酶消化，1∶3比例傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。MTT法測(cè)定細(xì)胞活力[6]，張氏肝細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/孔接于96孔板，于含15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)液更換為無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中添加10、50、100、500和1 000 nmol/L濃度的牛胰島素，孵育20 h后，棄培養(yǎng)液并向每孔加入100 μL MTT溶液(將MTT以0.5 mg/mL溶于無(wú)血清的RPMI 1640培養(yǎng)液)，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μL DMSO溶解結(jié)晶甲瓚，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處吸光度值。

1.2.2 張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗模型的建立

1.2.2.1 最佳濃度的確定

采用高濃度胰島素體外誘導(dǎo)培養(yǎng)法建立張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型[7]。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞消化后，以1×105個(gè)細(xì)胞每孔接于24孔板中培養(yǎng)，用含15%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，更換培養(yǎng)液為1%FBS和含不同濃度(10、50、100、500和1 000 nmol/L)牛胰島素的RPMI 1640培養(yǎng)液，設(shè)不含胰島素組為對(duì)照組，在5% CO2、37 ℃飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 最佳作用時(shí)間的確定

確定胰島素作用最佳濃度后，重復(fù)“1.2.2.1”方法，設(shè)不含胰島素組為對(duì)照組，模型組加入新配制的含有最佳作用濃度的胰島素培養(yǎng)液，胰島素作用時(shí)間分別為12、24、36和48 h。

1.2.2.3 模型的鑒定

采用葡萄糖測(cè)定試劑盒，將“1.2.2.1”和“1.2.2.2”所述細(xì)胞更換無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液，在5% CO2、37 ℃和飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后測(cè)定培養(yǎng)液中葡萄糖含量，將試劑1和試劑2等比例混合配成1 mL工作液，并充分混勻，24孔板每孔取10 μL培養(yǎng)液加至工作液中，設(shè)空白管和標(biāo)準(zhǔn)管，充分混勻，37 ℃保溫15 min，于505 nm處測(cè)定各管吸光度，根據(jù)測(cè)定管與標(biāo)準(zhǔn)管吸光空度比值即可算出培養(yǎng)液中葡萄糖含量。培養(yǎng)液中葡萄糖含量與無(wú)血清RPMI 1640培養(yǎng)液中葡萄糖含量差值即為每孔細(xì)胞葡萄糖消耗量(mmol/L)，將此葡萄糖消耗量作為鑒定細(xì)胞胰島素抵抗模型的指標(biāo)。

1.2.3 模型持續(xù)時(shí)間的研究

胰島素抵抗細(xì)胞模型持續(xù)時(shí)間的研究采用“1.2.2.1”和“1.2.2.2”建立的方法，將模型細(xì)胞置于不含胰島素的培養(yǎng)基中孵育48 h后，用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)基的葡萄糖含量，并計(jì)算每孔細(xì)胞葡萄糖消耗量。

1.2.4 形態(tài)學(xué)變化

利用倒置相差顯微鏡觀察建模前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)用±s表示, 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。同組不同濃度間比較采用方差分析，P<0.01為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著。

2 結(jié)果與討論

2.1 高濃度胰島素對(duì)張氏肝細(xì)胞增值的影響

如圖1所示在10、50、100、500和1 000 nmol/L濃度范圍內(nèi)，胰島素并未對(duì)張氏肝細(xì)胞增殖產(chǎn)生顯著影響。

圖1 高濃度胰島素對(duì)細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Cell viability of Chang liver cells incubated with high concentration of insulin

MTT可以被線粒體內(nèi)的一些脫氫酶還原生成結(jié)晶狀的深紫色產(chǎn)物甲瓚(Formazan)。在特定溶劑存在的情況下，可以被完全溶解。通過(guò)酶標(biāo)儀可以測(cè)定570 nm波長(zhǎng)附近的吸光度。細(xì)胞增殖越多越快，則吸光度越高；藥物的細(xì)胞毒性越大，則吸光度越低。由圖1可見(jiàn)，高濃度胰島素并未改變吸光度值，因此，對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響。

2.2 模型的建立

如圖2所示，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入胰島素后，在各濃度胰島素刺激下張氏肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性降低，胰島素誘導(dǎo)各組細(xì)胞葡萄糖消耗均顯著低于對(duì)照組(P<0.001)，說(shuō)明張氏肝細(xì)胞已形成胰島素抵抗。當(dāng)胰島素濃度為100 nmol/L時(shí)，細(xì)胞葡萄糖消耗與對(duì)照組比較顯著降低了18.77%(P<0.001)，表明100 nmol/L濃度胰島素對(duì)張氏肝細(xì)胞葡萄糖消耗影響最大，即100 nmol/L為建立張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗模型的最佳胰島素濃度。為進(jìn)一步確定最佳建模時(shí)間，在張氏肝細(xì)胞培養(yǎng)液中加入100 nmol/L胰島素分別孵育12、24、36和48 h。結(jié)果如圖3所示，張氏肝細(xì)胞在含胰島素的細(xì)胞培養(yǎng)液中孵育

圖2 胰島素濃度對(duì)張氏肝細(xì)胞葡萄糖消耗的影響(*P<0.001)Fig.2 Effect of insulin concentration on inducing IR Chang liver cells

圖3 胰島素孵育時(shí)間對(duì)張氏肝細(xì)胞葡萄糖消耗的影響(**P<0.001， *P<0.01)Fig.3 Effect of insulin incubation time on inducing IR Chang liver cells

12 h細(xì)胞葡萄糖消耗并未發(fā)生明顯變化，當(dāng)孵育時(shí)間延長(zhǎng)到24 h時(shí)，細(xì)胞葡萄糖消耗與對(duì)照組相比顯著降低了8.96%(P<0.001)。而當(dāng)孵育時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)時(shí)雖然細(xì)胞葡萄糖消耗障礙仍然存在，但持續(xù)的低血清孵育對(duì)細(xì)胞狀態(tài)影響較大，因此，100 nmol/L胰島素孵育24 h為建立胰島素抵抗張氏肝細(xì)胞模型的最佳條件。

2.3 模型穩(wěn)定時(shí)間

研究細(xì)胞模型的穩(wěn)定時(shí)間，為建立可靠的張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗模型提供了依據(jù)。如圖4所示，將模型細(xì)胞置于不含胰島素的培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)12、24、36和48 h使胰島素受體的數(shù)目上調(diào)，再測(cè)定對(duì)照組和模型組細(xì)胞的葡萄糖消耗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)36 h內(nèi)模型細(xì)胞的葡萄糖消耗仍然明顯低于對(duì)照組細(xì)胞(P<0.001)，即建模36 h后張氏肝細(xì)胞仍然存在葡萄糖攝取和利用障礙。說(shuō)明細(xì)胞模型在36 h內(nèi)具有穩(wěn)定性。

圖4 張氏肝細(xì)胞胰島素抵抗細(xì)胞模型持續(xù)時(shí)間的研究(**P<0.001， * P<0.01)Fig.4 Insulin resistance Chang liver cell model stability

2.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

由圖5所示，對(duì)照組和模型組細(xì)胞在倒置相差顯微鏡下觀察時(shí)并未出現(xiàn)顯著形態(tài)學(xué)變化。

圖5 對(duì)照組和模型組細(xì)胞形態(tài)學(xué)(×200)Fig.5 Morphocytology of control and model (×200)

3 結(jié) 論

本文利用葡萄糖檢測(cè)試劑盒(GOD-POD法)檢測(cè)細(xì)胞葡萄糖消耗, 較準(zhǔn)確的判斷細(xì)胞是否存在胰島素抵抗。研究結(jié)果顯示, 運(yùn)用高胰島素誘導(dǎo)培養(yǎng)法可使張氏肝細(xì)胞葡萄糖消耗顯著降低，且發(fā)生葡萄糖攝取和利用障礙, 即發(fā)生胰島素抵抗。研究過(guò)程中采用葡萄糖檢測(cè)試劑盒鑒定胰島素抵抗, 與目前其他實(shí)驗(yàn)室采用的同位素標(biāo)記2-DG的攝取或糖原合成的判斷指標(biāo)[8]相比, 此法更接近臨床糖尿病糖檢測(cè)手段, 而且污染小、經(jīng)濟(jì)、方便, 更重要的是檢測(cè)后的細(xì)胞可用作進(jìn)一步的研究材料, 這點(diǎn)是同位素標(biāo)記的糖檢測(cè)法無(wú)法實(shí)現(xiàn)的。

本文建立的胰島素抵抗張氏肝細(xì)胞模型, 可廣泛用于在細(xì)胞水平探討胰島素抵抗的形成機(jī)制和糖脂代謝障礙的病理生理學(xué)環(huán)節(jié)。同時(shí)便于觀察干預(yù)因素對(duì)胰島素抵抗的直接影響, 更便于篩選改善胰島素抵抗的藥物。由于一些腫瘤細(xì)胞本身也存在胰島素抵抗, 因此本模型的可靠性優(yōu)于肝腫瘤細(xì)胞模型。而且張氏肝細(xì)胞保持著與人體內(nèi)肝細(xì)胞基本相同的結(jié)構(gòu)、生物學(xué)特性和功能, 既無(wú)成瘤性, 又具有持久增殖能力便于體外培養(yǎng), 與動(dòng)物模型[9]相比, 此細(xì)胞模型具有復(fù)制周期短、價(jià)格低廉、易于重復(fù)、便于控制等優(yōu)點(diǎn)。

綜上所述, 用含100 nmol/L胰島素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h的張氏肝細(xì)胞產(chǎn)生胰島素抵抗, 稱為胰島素抵抗張氏肝細(xì)胞, 可用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

[1] ZIMMET P, ALBERTI K G, SHAW J. Global and societal implications of the diabetes epidemic[J]. Nature, 2001, 414(6865):782-787.

[2] RENSTROM F, BUREN J, SVENSSON M, et al. Insulin resistance induced by high glucose and high insulin precedes insulin receptor substrate l protein depletion in human adipocytes[J]. Metabolism, 2007, 56(2):190-198．

[3] YAMAMSHITA R, SAITO T, SARAH S, et al. Effects of dehydroepiandrosterone on gluconeogenic enzymes and glucose uptake in human hepatoma cell line, HepG2 [J]. Endocrine Journal, 2005, 52(6):727-733.

[4] 林滬,毛青,王宇明,等. L02細(xì)胞人鼠嵌合肝模型的建立[J]. 中華肝病雜志, 2006, 14(8):578-581.

[5] JEFFREY E, ALAN R. Signaling pathways insulin action: molecular targets of insulin resistance[J]. Journal of Clinical Investigation, 2000, 106(2):165-169.

[6] VISTICA D T, SKEHAN P, SCUDIERO D. Tetrazolium-based assays for cellular viability: a critical examination of selected parameters affecting formazan production[J]. Cancer Research, 1991, 51(10):2515-2520.

[7] GAO D, GRIFFITHS H R, BAILEY C J. Oleate protects against palmitate-induced insulin resistance in L6myotubes[J]. British of Journal Nutrition, 2009, 102(11):1557-1563.

[8] 陳秋,夏永鵬,邱宗蔭. 吡格列酮對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型的藥理學(xué)評(píng)價(jià)[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2006, 22(2):248-251.

[9] LIU Z, ARONSON J, WAHL E C, et al. A novel rat model for the study of deficits in bone formation in type-2 diabetes[J]. Acta Orthopaedica, 2007, 78(1):46-55.