孫 筱 筠， 張 宗 申

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

東北紅豆杉又名紫杉，是國家Ⅰ級重點(diǎn)保護(hù)植物。近年來，人們從東北紅豆杉根、莖、葉中分離出抗癌活性成分——紫杉醇[1-2]。研究表明：紫杉醇能與微管蛋白結(jié)合，并促進(jìn)其聚合，抑制癌細(xì)胞的有絲分裂，阻止癌細(xì)胞的增殖，具有明顯的抗白血病、肺癌、卵巢癌、乳腺癌的作用[3]。據(jù)分析，我國4個(gè)紅豆杉品種中以東北紅豆杉枝葉中所含的紫杉醇最高[4]。紅豆杉屬植物在自然條件下種子萌發(fā)率低，再加上屬于雌雄異株，自然結(jié)種率低，種質(zhì)資源少，種子休眠期長等原因繁殖速度慢[5]，因此通過自然種子繁殖紅豆杉受到很大限制。與通過自然種子的繁殖方式相比，人工種子具有繁殖速度快、節(jié)省資金、人力和土地等優(yōu)點(diǎn)，因此對于紅豆杉屬物種的保護(hù)和藥用價(jià)值具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材 料

愈傷組織：取大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)種植的東北矮紫杉嫩莖，在mB5[6]培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織，每25天繼代1次，(24±1)℃下黑暗培養(yǎng)，挑選乳白色、質(zhì)地松散、表面呈顆粒狀的愈傷組織作為繁殖體。

腋芽在大連地區(qū)4月份的矮紫杉枝條上采取。

1.2 方 法

1.2.1 用愈傷組織制作人工種子

包埋劑濃度的選擇:將愈傷組織切成直徑2～3 mm的小塊，放入不同濃度的海藻酸鈉溶液中(見表1，用mB5培養(yǎng)基配制)充分混合，浸泡3～4 min，然后用膠頭滴管每次吸取1個(gè)繁殖體滴入2.5% CaCl2溶液中。形成的人工種子用無菌水沖洗3～4次，置于無菌紙上吸去人工種子表面水分。將制作好的人工種子置于鋪有無菌水浸潤濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)溫度(24±1)℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。觀察人工種子形態(tài)并每5 d測量1次失水率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

人工胚乳成分的配制：在mB5培養(yǎng)基配制的3.0%海藻酸鈉溶液中，分別添加不同濃度的可溶性淀粉、草酸、水楊酸、低分子殼聚糖和高分子殼聚糖，然后用愈傷組織制備人工種子(CaCl2質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%)。觀察人工種子形態(tài)并每5 d測量1次失水率，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.2 用腋芽制作人工種子

植物生長調(diào)節(jié)劑的優(yōu)化：將剝?nèi)〉囊秆坑?5%酒精處理30 s，再于0.1%升汞溶液中處理5 min，然后用無菌水沖洗3～5次。在包埋基質(zhì)中添加不同種類及濃度的生長調(diào)節(jié)劑(包埋基質(zhì)為3.0%海藻酸鈉溶液，包含mB5培養(yǎng)基、3.0%蔗糖、1.5%可溶性淀粉、10-6mg/L水楊酸)，絡(luò)合電解質(zhì)為2.5% CaCl2。將制好的人工種子置于含有相應(yīng)生長調(diào)節(jié)劑的mB5固體培養(yǎng)基上進(jìn)行萌發(fā)，培養(yǎng)溫度(24±1)℃，每天光照12 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx，30 d后統(tǒng)計(jì)人工種子萌發(fā)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 包埋劑濃度對用愈傷組織制備的東北矮紫杉人工種子包埋效果及保水性的影響

不同濃度的海藻酸鈉對人工種子形成的質(zhì)量、形成時(shí)間和保水性都有影響。隨著海藻酸鈉濃度的升高，人工種子形成的時(shí)間縮短，保水性也越來越好。由表1和表2可以看出，海藻酸鈉濃度過低，形成的人工種子的時(shí)間較長，顆粒不均，種子較軟容易粘連；濃度過高，雖然形成的人工種子顆粒均一，但硬度大、不透明，會阻礙種子的萌發(fā)。只有3.0%海藻酸鈉包埋制成的人工種子大小均勻，硬度適中，透明而富有彈性，所以3.0%海藻酸鈉在2.5% CaCl2中反應(yīng)8～10 min是制備人工種子的最佳條件(見圖1a)。

表1 不同濃度包埋劑對人工種子質(zhì)量、形成時(shí)間的影響Tab.1 The effects of different concentration on encapsulation formulation of artificial seeds

表2 不同濃度包埋劑包埋人工種子的失水情況(24 ℃)Tab.2 The effects of embedding agent concentration on the water loss of artificial seeds (24 ℃)

a, 3.0%海藻酸鈉+2.5%CaCl2制成的人工種子; b, 萌發(fā)前的人工種子; c, 萌發(fā)后的人工種子

2.2 添加可溶性淀粉、誘導(dǎo)子對用愈傷組織制備的人工種子包埋效果及保水性的影響

在包埋基質(zhì)中添加可溶性淀粉、草酸、水楊酸和殼聚糖對人工種子保水性均有較大影響。如表3所示，添加可溶性淀粉可以提高種子的保水性，其中添加1.5%可溶性淀粉的失水率最低，儲藏15 d后失水率為25.29%。這可能與可溶性淀粉的多孔結(jié)構(gòu)能夠增加對水分的吸附作用、從而導(dǎo)致水分散失緩慢有關(guān)；但是可溶性淀粉含量越高，制備出來的種子黏性也越大，種子之間更容易粘連，并且黏度越大，種子的透氣性相對也越差，這些因素對種子的萌發(fā)會有一定的抑制作用。添加草酸和水楊酸對人工種子保水性差別不大，均在24%～35%，且硬度適中對種子形成時(shí)間及形態(tài)影響較小。其中，以添加10-6mg/L水楊酸的種子顆粒最均一，色澤最好。在包埋基質(zhì)中添加的殼聚糖濃度越高，種子形成的時(shí)間越短，保水性也越好。但是添加殼聚糖形成的種子雖然顆粒均一，但顏色暗黃，硬度過大，可能影響種子萌發(fā)。

在制備人工種子的過程中，在胚乳中添加可溶性淀粉和誘導(dǎo)子可以改善人工種子的保水性，從而提高了人工種子的保存時(shí)間。但從上述結(jié)果分析，在添加可溶性淀粉和誘導(dǎo)子的時(shí)候，要綜合考慮其對種子質(zhì)量的影響，選擇適宜的添加濃度是關(guān)鍵。

表3 可溶性淀粉、草酸、水楊酸、殼聚糖對東北矮紫杉人工種子的保水效果(24 ℃)Tab.3 The effects of soluble starch, oxalate acid, salicylic acid and chitosan on the water retenation of artificial seeds (24 ℃)

2.3 添加植物生長調(diào)節(jié)劑對用腋芽制備的矮紫杉人工種子萌發(fā)的影響

在胚乳中單獨(dú)添加NAA對矮紫杉人工種子的萌發(fā)有較大的促進(jìn)作用。由表4可以看出，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著NAA濃度增加，種子萌發(fā)率上升，以1.5 mg/L NAA的促進(jìn)效果最好，培養(yǎng)30 d 后萌發(fā)率達(dá)到了38.1%；然而，隨著6-BA濃度的增加，人工種子的萌發(fā)率呈下降趨勢。

表4 植物生長調(diào)節(jié)劑對矮紫杉人工種子萌發(fā)率的影響Tab.4 The effects of plant growth regulator on the germination rate of artifical seeds of Taxus cuspidata CV.Nana

由表4可以看出，與單獨(dú)添加NAA和6-BA相比，同時(shí)添加NAA和6-BA對東北矮紫杉人工種子的萌發(fā)有一定的抑制作用，而不添加任何激素的人工種子也能萌發(fā)，這可能是因?yàn)闁|北矮紫杉的腋芽本身帶有的激素濃度可以保證其萌發(fā)的需要，但萌發(fā)率并不高。

3 討 論

海藻酸鈉凝膠包埋系統(tǒng)具有無毒且價(jià)格低廉、工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，因此本試驗(yàn)采用海藻酸鈉作為東北矮紫杉人工種子的包埋系統(tǒng)。試驗(yàn)得出東北矮紫杉人工種子的最佳制作條件為3%海藻酸鈉在2.5% CaCl2中反應(yīng)8～10 min。然而從試驗(yàn)中可以看出海藻酸鈉包埋系統(tǒng)保水性較差，至使水溶性養(yǎng)分很快浸出，另外制成的人工種子只能短期儲存，在萌發(fā)出芽時(shí)常常受阻。故今后的研究應(yīng)尋找更適合于人工種子實(shí)際應(yīng)用的固形包埋基質(zhì)。

黃紹興等[7]將木薯淀粉加入到海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)中制成復(fù)合包埋基質(zhì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)改善了由單一海藻酸鈉凝膠系統(tǒng)制作的人工種子胚乳的吸水性，從而提高了人工種子的發(fā)芽率。本試驗(yàn)在人工胚乳中添加可溶性淀粉對人工種子的保水性和質(zhì)量起到了促進(jìn)的作用，但濃度是關(guān)鍵因子，太高會影響種子的物理性質(zhì)，如黏度等，對人工種子的萌發(fā)會有一定的影響。

李烜赫等[8]在誘導(dǎo)子對紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇產(chǎn)量的影響研究中發(fā)現(xiàn)，生物或非生物誘導(dǎo)子可誘導(dǎo)紅豆杉細(xì)胞產(chǎn)生抗逆反應(yīng)，啟動次生代謝途徑，從而導(dǎo)到紫杉醇的大量合成。草酸和水楊酸作為誘導(dǎo)子添加到人工種子中對人工種子質(zhì)量影響效果不大，但提高了種子的保水性和形態(tài)，其中以10-6mg/L水楊酸的效果最好，人工種子顆粒最均一，成色最好，且濃度低，可節(jié)約制作成本。

高分子殼聚糖和低分子殼聚糖對人工種子的保水性和成形時(shí)間及顏色都有顯著的影響。含量越高保水性越好，同時(shí)成形時(shí)間越短，但種子硬度很大，顏色很深，對人工種子的萌發(fā)會有一定的抑制作用。因此，今后對人工胚乳添加成分上還要作進(jìn)一步的研究，以便對人工種子進(jìn)行更好的儲藏。

在人工胚乳中加入NAA有利于人工種子的萌發(fā)，以1.5 mg/L NAA對人工種子萌發(fā)促進(jìn)效果最為顯著，萌發(fā)率達(dá)到了38.1%，而6-BA則有一定的抑制作用。雖然本實(shí)驗(yàn)中人工種子能夠萌發(fā)，但萌發(fā)率并不高。因此，今后需要對提高東北矮紫杉人工種子萌發(fā)率的技術(shù)繼續(xù)研究。

[1] 李伯林,趙群華. 紅豆杉植物愈傷組織的培養(yǎng)及紫杉醇形成初探[J]. 南京大學(xué)學(xué)報(bào), 1995, 31(3):55-58.

[2] 吳曉慶. 抗腫瘤新藥紫杉醇研究進(jìn)展[J]. 中國生化藥物雜志, 1996, 17(3):13l-l35.

[3] 陳慶紅,陳慶瑛,黃利亞,等. 東北紅豆杉開發(fā)研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源, 2005, 24(1):41-42.

[4] 車熙哲,趙傳彥,趙海濤. 東北紅豆杉的發(fā)展前景與效益分析[J]. 特種經(jīng)濟(jì)動植物, 2004(5):26-27.

[5] 陳慶紅,陳慶瑛,黃利亞,等. 東北紅豆杉開發(fā)研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源, 2005, 24(1):41-42.

[6] LEE B S, SON S H. A method for the producing taxol and taxanes from embryo cultures of Taxus species:Europe, WO 9502063[P]. 1995-07-12[2009-10-09]. http://www.wipo.int/pctdb/en/wo.jsp?IA=KR1994000088&DISPLAY=DESC.

[7] 黃紹興,黃美娟,朱澂. 木薯淀粉對人工胚乳性能及對人工種子發(fā)芽率的影響[J]. 生物工程學(xué)報(bào), 1995, 11(1):39-44.

[8] 李烜赫,楊坤. 誘導(dǎo)子對紅豆杉培養(yǎng)細(xì)胞紫杉醇產(chǎn)量的影響[J]. 生物學(xué)通報(bào), 2006, 41(6):55-57.