楊麗娜，江勇，劉全忠

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211）

泌尿生殖道沙眼衣原體對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類藥物的體外藥敏研究

楊麗娜1，2，江勇2，劉全忠1

（1.天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院，天津300052；2.天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，天津 300211）

目的 研究紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素三種大環(huán)內(nèi)酯類藥物對(duì)泌尿生殖道沙眼衣原體體外藥敏試驗(yàn)，評(píng)價(jià)藥敏結(jié)果和臨床療效的關(guān)系，以指導(dǎo)臨床用藥。方法 采用細(xì)胞培養(yǎng)和碘染包涵體計(jì)數(shù)的方法，將采集到的符合要求的237株臨床株進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并對(duì)其中52株感染率達(dá)90%以上的標(biāo)本進(jìn)行3種大環(huán)內(nèi)酯類的藥敏試驗(yàn)。結(jié)果 共培養(yǎng)出沙眼衣原體82株，陽(yáng)性率為34.60%。感染率達(dá)90%的52株藥敏結(jié)果（MIC）分別為紅霉素0.25～ 2μg/mL，阿奇霉素0.063～1.000μg/mL，克拉霉素0.004～0.064μg/mL。結(jié)論 共發(fā)現(xiàn)13株紅霉素耐藥株，未發(fā)現(xiàn)對(duì)其他2種抗菌藥耐藥的菌株，但阿奇霉素MIC較以前報(bào)道升高。

沙眼衣原體；大環(huán)內(nèi)酯類；藥敏試驗(yàn)

Abstract：ObjectiveTo evaluate the activities of three macrolides agianst Chlamydia trachomatis（CT）by antimicrobial susceptibility testing.MethodsCell culture and iodine staining of chlamydia inclusions were used to culture 237 clinical samples and to determine MICs of three macrolides against 52 samples which infection rate was beyond 90%.Results82 strains out of 237 clinic isolates were postive for CT,the postive rate was 34.60%.The MICs of Erythromycin,Azithromycin and Clarithromycin,the three macrolides against 52 samples were 0.25～2ug/ml,0.063～1.000ug/ml,0.004～0.064ug/ml,respectively.Conclusion13 strains were found resistant to Erythromycin,none resistant strain was found to Azithromycin and Clarithromycin.But the MIC of Azithromycin was higher than before.

Key words：Chlamydia trachomatis；macrolides；drug sensitive test

沙眼衣原體（Chlamydia trachomatis，CT）是一種嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生菌，所致的泌尿生殖道感染在發(fā)達(dá)國(guó)家和某些地區(qū)已成為最常見(jiàn)的性傳播疾病。在我國(guó)其發(fā)病率于2001年也位于8種性病之首[1]。研究報(bào)道它還是人類免疫缺陷病毒（HIV）和女性宮頸癌有關(guān)。大環(huán)內(nèi)酯類藥物在治療CT感染時(shí)比較常用，且阿奇霉素是美國(guó)疾病防治中心推薦治療性病沙眼衣原體的一線藥物[2]。隨著其在臨床上的廣泛應(yīng)用，目前臨床上治療失敗的報(bào)道愈來(lái)愈多，有關(guān)其耐藥的報(bào)道也逐年上升。為了了解CT對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類的耐藥情況，我們對(duì)臨床常用的紅霉素、阿奇霉素和克拉霉素進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本共收集2005年—2009年期間到天津市性傳播疾病研究所門診就診患者的尿道或?qū)m頸拭子237例，標(biāo)本經(jīng)直接免疫熒光法鏡下檢測(cè)到CT，且標(biāo)本淋球菌、支原體檢查陰性；所有患者取材前均停用任何抗菌藥物兩周以上。菌株經(jīng)過(guò)McCoy細(xì)胞培養(yǎng)和碘染色鑒定，放于-80℃冰箱中保存。

1.1.2 抗菌藥及工作液的配制 紅霉素 (850μg/mg)自美國(guó)Sigma公司，克拉霉素(972 U/mg)、阿奇霉素(936 U/mg)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。根據(jù)藥物溶解性不同分別把3種抗菌藥配制成高濃度的貯存液，然后用無(wú)抗感染液稀釋成一定濃度的工作液。市性傳播疾病研究所細(xì)胞培養(yǎng)室保存。

1.2 方法

1.2.1 CT培養(yǎng)應(yīng)用McCoy細(xì)胞培養(yǎng)法，對(duì)臨床采集的標(biāo)本接種傳代培養(yǎng)，碘染鏡下觀察結(jié)果。對(duì)陽(yáng)性標(biāo)本繼續(xù)傳代培養(yǎng)至感染率達(dá)90%以上，收集標(biāo)本分裝置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 藥物敏感性測(cè)定方法

1.2.2.1 接種量的確定 先確定能引起90%以上細(xì)胞感染的CT的接種量。

1.2.2.2 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定 每個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)立陰性對(duì)照（加藥物，但不接種CT)和陽(yáng)性對(duì)照(接種CT，但不加藥)。抗菌工作濃度參照文獻(xiàn)[2-4]，并以文獻(xiàn)推薦濃度為中間濃度，設(shè)6個(gè)等比稀釋濃度。首先在96孔板中制備致密單層細(xì)胞每孔（1～2）×105細(xì)胞。根據(jù)已確定的接種量接種CT，32℃，3 000r/min，離心1 h后置于37℃、5%CO2溫箱孵2h。然后棄液，加入無(wú)抗感染液及配制好的相應(yīng)的待測(cè)抗菌藥工作液，依次倍比稀釋，使抗菌藥形成不同濃度。然后同前條件孵育44～48 h左右，孔板風(fēng)干固定后，經(jīng)碘染色鏡下觀察結(jié)果。鏡下觀察未見(jiàn)有CT包涵體的最小稀釋濃度即為測(cè)試藥MIC。

1.2.2.3 藥敏結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn) 目前國(guó)內(nèi)外對(duì)CT體外藥敏結(jié)果的判定尚無(wú)公認(rèn)且統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。本實(shí)驗(yàn)參照細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)，采用三級(jí)劃分制，高度敏感：MIC顯著低于常規(guī)用藥時(shí)血藥濃度和組織濃度；中度敏感：MIC等于常規(guī)用藥時(shí)血藥濃度和組織濃度。耐藥：MIC高于常規(guī)用藥時(shí)血藥濃度和組織濃度。3種抗菌藥物的血藥濃度分別為：紅霉素0.3～0.7μg/mL、克拉霉素1.0μg/mL、阿奇霉素0.4～0.45μg/mL。

2 結(jié)果

經(jīng)傳代培養(yǎng)237例臨床標(biāo)本共獲得82株培養(yǎng)陽(yáng)性CT，陽(yáng)性率為34.60%。對(duì)其中52株感染率超過(guò)90%的進(jìn)行體外藥敏試驗(yàn)，藥敏MIC結(jié)果分別為0.25～2μg/mL,阿奇霉素0.063～1.000μg/mL，克拉霉素0.004～0.064μg/mL,見(jiàn)表1。共發(fā)現(xiàn)13株紅霉素耐藥株(MIC>1μg/mL，且≤2μg/mL，MIC值超過(guò)血藥濃度和組織藥物濃度)，未發(fā)現(xiàn)對(duì)其他2種抗菌藥耐藥的菌株。

表1 3種大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥對(duì)沙眼衣原體臨床株的體外藥敏結(jié)果

3 討論

本次研究顯示，大環(huán)內(nèi)酯類藥物按MIC值由高到低的順序排列依次是紅霉素、阿奇霉素、克拉霉素。

研究測(cè)得紅霉素MIC值0.25～2g/mL，與韓建德等[3]報(bào)道的MIC為1.0～2.0μg/mL，研究結(jié)果相近，但與以往報(bào)道[4]相比，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明紅霉素的敏感性顯著降低，且發(fā)現(xiàn)13例紅霉素耐藥菌株，耐藥株所占比例較高(25%)，表明天津地區(qū)已出現(xiàn)紅霉素耐藥菌株，提示紅霉素已不適合泌尿生殖道CT感染的一線治療，需引起臨床工作者的高度重視。沙眼衣原體在體外顯示的是一種“異形耐藥”[5]，即沙眼衣原體包括敏感群體和耐藥群體。紅霉素的研究進(jìn)步證實(shí)了這一點(diǎn)，在MIC值顯示耐藥的情況下，我們可以發(fā)現(xiàn)少量的包涵體，有時(shí)僅為一、二個(gè)包涵體。說(shuō)明只有這一小部分對(duì)紅霉素耐藥。而紅霉素耐藥患者在使用紅霉素治療后，雖不能治愈，但是可以獲得臨床癥狀的緩解，進(jìn)步證實(shí)“異形耐藥”?；仡櫥颊叩呐R床資料，部分患者就診后未曾使用過(guò)紅霉素治療，而就診前有的患者已在院外使用過(guò)紅霉素，有的患者未用過(guò)因此考慮紅霉素耐藥株中既有原發(fā)耐藥又有獲得性耐藥。

阿奇霉素是新的大環(huán)內(nèi)酯類藥物，對(duì)CT具有較低抑菌、殺菌濃度。有效血藥濃度為0.4～0.45μg/mL。美國(guó)CDC推薦阿奇霉素1g單次口服治療衣原體感染時(shí)有效的，但是在3個(gè)月內(nèi)大約有15%～20%的患者持續(xù)感染或復(fù)發(fā)，4個(gè)月的臨床治愈只有65%～75%[6,7]。而我們?cè)谥委?個(gè)月后的陰轉(zhuǎn)率只有44.44%[8]，明顯低于國(guó)外報(bào)道。研究測(cè)得阿奇霉素的MIC值為0.25～1.0μg/mL，與韓建德等[3]報(bào)告的0.125～0.5μg/mL相比，敏感程度有所下降，而且其中40株菌株(76.92%)測(cè)定值已經(jīng)超過(guò)血藥濃度。雖然研究未發(fā)現(xiàn)阿奇霉素耐藥菌株，但是阿奇霉素耐藥趨勢(shì)明顯，不適合推薦作為治療泌尿生殖道CT感染的首先藥物。

研究測(cè)得克拉霉素MIC 0.004～0.032μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道[3]相當(dāng)，且抑菌濃度低，提示有較強(qiáng)的抗CT活性。其中1例紅霉素耐藥患者，使用其他種類抗菌藥物治療后復(fù)查支原體仍陽(yáng)性，后來(lái)改用克拉霉素治療復(fù)查支原體轉(zhuǎn)陰，說(shuō)明克拉霉素可試用于對(duì)紅霉素耐藥的菌株和頑固性病例的治療。臨床治療失敗與體外實(shí)驗(yàn)?zāi)退幹g相差較大[9]。雖然臨床上報(bào)道阿奇霉素和克拉霉素治療失敗病例，但在體外藥敏實(shí)驗(yàn)并未分離到的耐藥株?？赡艿脑颍孩倥R床治療失敗是由臨床上持續(xù)感染狀態(tài)引起，并未形成耐藥；②細(xì)胞傳代培養(yǎng)可能導(dǎo)致耐藥質(zhì)粒的丟失且體內(nèi)外環(huán)境存在較大差異。

［1］龔向東，葉順章，張君炎，等．1991～2001年我國(guó)性病流行病學(xué)分析[J]．中華皮膚科雜志，2002，35(3)：178-l82．

［2］Geisler WM.Management of uncomplicated Chlamydia trachomatis infections in adolescents and adults:evidence reviewed for the 2006 Centers for Disease Control and Prevention sexually transmitted diseases treatment guidelines[J].Clin Infect Dis,2007,44 Suppl 3: S77-S83.

［3］韓建德，陳開(kāi)木，廖綺曼，等．生殖道沙眼衣原體對(duì)幾種抗菌藥物敏感性的研究[J].中華皮膚科雜志，2006,39（10）：559-561．

［4］尚淑賢，夏隆慶，邵長(zhǎng)庚，等．不同抗菌藥物體外對(duì)沙眼衣原體的單獨(dú)和聯(lián)合抗菌作用觀察[J]．中華皮膚科雜志，2005，38（5）：282-284．

［5］Somani J,Bhullar VB,Workowski KA,et al．Multiple drug-resistant Chlamydia trachomatis associated with clinical treatment failure[J].J InfectDis,2000,181:1421-1427．

［6］Stamm WE.Chlamydia trachomatis—the persistent pathogen: Thomas Parran Award Lecture[J].Sex Transm Dis,2001,28: 684-689.

［7］Stamm WE,Hicks CB,Martin DH,et al.Azithromycin for empirical treatment of the nongonococcal urethritis syndrome in men.A randomized double-blind study[J].JAMA,1995，274:545-549．

［8］邵麗麗，江勇，楊麗娜，等．299例泌尿生殖道沙眼衣原體的檢測(cè)及藥物敏感性分析 [J]． 臨床皮膚科雜志，2010,39（3）：141-143．

［9］尚淑賢，王千秋．沙眼衣原體抗生素敏感性試驗(yàn)及臨床耐藥研究[J]．中華皮膚科雜志，2003,36（9）：540-542．

In Vitro Activities of Macrolides Against Chlamydia Trachomatis

YANG li-na1，2,JIANG Yong2,LIU Quan-zhong1
1.Tianjin Medical University General Hospital,Tianjin 300052,China;2.The Second Hospital of Tianjin Medical University, Tianjin300211,China

R374+.1

B

1672－0709（2010）05-0298－02

2010-06-30)

國(guó)家自然科學(xué)基金（30671879）

劉全忠，Email：liuquanzhong@medmail.com.cn

楊麗娜：現(xiàn)在天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院工作