孫躍輝,黃金海*,郭立力,楊愛華,粱智選,劉 瑩

(1.天津大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物工程學(xué)院,天津 300072;2.天津市動物疫病預(yù)防控制中心,天津 300402)

豬繁殖與呼吸綜合征(Procine rep roductive and respiratory syndrom e,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Procine rep roductive and respiratory synd rome virus,PRRSV)引起的一種以妊娠母豬繁殖障礙以及仔豬的呼吸道癥狀和高死亡率為特征的傳染病[1]。PRRS于1987年首次在美國南部暴發(fā)并報(bào)道,隨后在短短的幾年迅速流行于全美,隨之加拿大、德國、荷蘭等北美洲及歐洲國家也先后報(bào)道發(fā)生該病[2-3],并已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的傳染病之一。

PRRSV全基因組長約15 kb,包括9個(gè)開放閱讀框(ORFs),越來越多的研究表明,不同 PRRSV的變異分布于整個(gè)基因組,但以N sp2的變異最大[4-5]。Nsp2基因長度 2.9 kb,位于 PRRSV的ORF1a區(qū),在不同的毒株中序列存在著長度不一的缺失,因此對Nsp2的分析在一定程度上可以反映病毒基因組序列的變異情況[6]。本研究從天津市疑似豬藍(lán)耳病病例中分離得到3株P(guān)RRSV,其中包括兩株N sp2缺失毒株 TJ-S1、TJ-S2,并對其 Nsp2序列進(jìn)行分析,參考國內(nèi)外已發(fā)表基因序列構(gòu)建基因系統(tǒng)進(jìn)化樹,以闡明分離株TJ-S1、TJ-S2和 TJ-S3的基因型和遺傳進(jìn)化地位,豐富PRRSV分子流行病學(xué)資料,進(jìn)而為PRRS的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒分離株、菌株和細(xì)胞 PRRSV分離株TJ-S1株、TJ-S2株、TJ-S3株,分別分離自天津薊縣、靜海、河北黃驊發(fā)病豬,置-40℃冰箱中保存;E.co li DH5α菌株、Marc-145細(xì)胞由本室保存。

1.1.2 主要試劑 TRIzol-A+總RNA提取試劑、Taq DNA聚合酶購自天根生化科技(北京)有限公司;AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、pGEM-T Easy載體購自Prom ega公司;DNA M arker購自北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司;DNA膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) 根據(jù) B J-4、HB-1、HB-2、VR2332以及CH-la毒株的核苷酸序列比對結(jié)果,運(yùn)用O ligo6.0軟件根據(jù) BJ-4株序列設(shè)計(jì)出擴(kuò)增Nsp2基因高變區(qū)部分序列的3條引物,其中r-Nsp2(5′-AAGCCATTCCTGGT-3′)為 反 轉(zhuǎn) 錄 引 物,Nsp2-FP (5′-CCTCCGTGGTGCAACAAATCT TG-3′) 和 Nsp2-LP(5′-CGATGATGGCTTGAGCTGAGTAT-3′)是擴(kuò)增高變區(qū)的上下游引物。

1.2.2 病毒RNA的提取 取病毒的細(xì)胞培養(yǎng)物250μL,置于DEPC水處理過的1.5 mL滅菌離心管中,然后按照TRIzol-A+總RNA提取試劑說明,提取總RNA。

1.2.3 Nsp2基因的擴(kuò)增 20μL反轉(zhuǎn)錄體系為:總RNA 12.5μL,加入反轉(zhuǎn)錄引物(25 pm ol/μL)1μL,dNTP M ixture(10 mmol/L each)1 μL,RNase抑制劑 0.5μL(30 U/μL)、A MV 反轉(zhuǎn)錄酶1μL(10 U/μL)及5×RT緩沖液4μL,42 ℃反應(yīng)2 h,然后95℃變性5 min,即可作為 PCR模板。

PCR反應(yīng)體系為:反應(yīng)總體積50μL,內(nèi)含10×PCR緩沖液 5μL,dNTP Mixture(2.5 mmol/L each)4μL,上下游引物(25 pmo l/μL)各 1μL,Taq DNA 聚合酶(2.5 U/μL)1μL,cDNA 5μL,加水至50μL。PCR程序?yàn)?94℃預(yù)變性5 min;94℃45 s,56℃45 s,72℃45 s,共35個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

取PCR產(chǎn)物5μL,用15 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測,凝膠成像系統(tǒng)觀察擴(kuò)增情況。

1.2.4 目的基因的克隆和鑒定 參照DNA膠回收試劑盒說明,回收目的基因條帶,按照pGEM-T Easy載體說明將目的基因連接到pGEM-T載體中,轉(zhuǎn)化E.coli DH 5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取白斑,接種于含有氨芐青霉素(100μg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)過夜,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定,篩選出陽性重組菌,交由北京六合華大基因科技股份有限公司測序。

1.2.5 序列分析 測序結(jié)果用 BLAST和DNA Star軟件分析,并與GenBank中已報(bào)道的Nsp2核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列進(jìn)行同源性比較,構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

2 結(jié)果

2.1 目的基因的克隆及陽性克隆的鑒定

用RT-PCR的方法擴(kuò)增出Nsp2基因,獲得與預(yù)期片段大小相符的特異性條帶,大小約為1 100 bp(圖1)。所選陽性克隆,經(jīng)過 PCR鑒定,均出現(xiàn)預(yù)期的目的片段。

2.2 序列測定

陽性克隆的DH 5α菌液送北京六合華大基因科技股份有限公司測序。通過BLAST分析表明,擴(kuò)增得到的序列為PRRSV的N sp2基因,與預(yù)期結(jié)果相符合,并已遞交GenBank,分別命名為Nsp2-TJS1(登錄號 GQ923891)、Nsp2-TJ-S2株(登錄號GQ923892)、N sp2-TJ-S3株(登錄號:GQ923893),其中N sp2-TJ-S2、Nsp2-TJ-S3存在30個(gè)氨基酸的不連續(xù)缺失。

2.3 序列分析結(jié)果

3株P(guān)RRSV天津分離株的Nsp2基因與已發(fā)表的VR2332 株 、HB-1a 株 、SD-14 株 、HuN 株 、BJ-4 株和CH-1a株的核苷酸和氨基酸的同源性比較結(jié)果見表1。3株P(guān)RRSV天津分離株Nsp2基因核苷酸序列之間的同源性為91.0%～99.5%,推導(dǎo)編碼的氨基酸序列之間的同源性為88.1%～99.2%,其中TJ-S1株和 TJ-S2株Nsp2基因高度相似,相比 TJ-S3株、VR2332株、HB-1株、BJ-4株和CH-1a株在第 221位和第272～300位氨基酸發(fā)生缺失(圖2)。

從遺傳進(jìn)化樹(圖3)可見,PRRSV可以分為兩個(gè)類群,以VR-2332為代表的美洲株和以LV為代表的歐洲株,3株天津分離株都屬于美洲株,其中TJ-S1株、TJ-S2株與HuN株、SD-14株遺傳距離相對較近,TJ-S3株與CH-1a株的遺傳距離較近。

表1 PRRSV Nsp2基因核苷酸和氨基酸序列同源性比較結(jié)果Table1 The hom ologies of nucleotide and amino acid sequences of Nsp2 gene of PRRSVs %

圖2 Nsp2基因推導(dǎo)編碼的氨基酸序列與國內(nèi)外毒株的序列比較Fig.2 A lignm ent of deduced amino acids of obtained Nsp2 gene with other PRRSV isolates

圖3 Nsp2基因遺傳進(jìn)化樹Fig.3 Phy logenetic tree of Nsp2 gene

3 討論

自從豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS)于20世紀(jì)80年代發(fā)生以來,該病已成為危害世界養(yǎng)豬業(yè)的重大疾病之一,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[7]。我國于1995年始發(fā)此病[8],并迅速傳播至全國各地,2006年高致病性的PRRS在江西爆發(fā),隨后蔓延至北京、河北、河南、湖南、廣東等主要養(yǎng)豬省市,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了較大災(zāi)難[9-10],其中PRRSV的變異是造成本病難以控制的重要原因之一。

PRRSV以特有的套式轉(zhuǎn)錄方式進(jìn)行病毒粒子的復(fù)制增殖,這種獨(dú)特的轉(zhuǎn)錄方式使其基因組極易發(fā)生變異[11],除堿基點(diǎn)突變頻率較高外,PRRSV基因組還常發(fā)生片段的插入或缺失變異,尤其在Nsp2基因區(qū)域。PRRSV出現(xiàn)之初,美洲型毒株的Nsp2基因大小約為 2.9 kb,VR2332株、BJ-4株、CH-1a株等為這一類型,隨著時(shí)間的推移,N sp2基因發(fā)生缺失的PRRSV毒株不斷出現(xiàn),2002年在河北省分離的HB-2(SH)/2002株Nsp2基因出現(xiàn)36個(gè)堿基連續(xù)缺失[12],2006年在江西省又分離到另一缺失程度更大的PRRSV毒株(JX-A 1株)[13]。JX-A 1株的Nsp2基因存在2處共90個(gè)堿基缺失,其中一處缺失87個(gè)堿基,另一處缺失3個(gè)堿基,2006年后國內(nèi)大范圍流行的毒株即為這一類型。因?yàn)椴迦牖蛉笔筆RRSV的N sp2基因具有長度多態(tài)性,這一特點(diǎn)可用于PRRSV經(jīng)典毒株和變異毒株的鑒別。

本研究對3株天津PRRSV分離株的Nsp2基因進(jìn)行了克隆和序列測定,并與VR2332株、HB-1株、SD-14株、HuN 株、BJ-4株和CH-1a株的相應(yīng)序列進(jìn)行了比較分析,結(jié)果表明分離的3株病毒都屬于美洲型毒株,其中TJ-S3株和國內(nèi)分離株CH-1a株Nsp2基因同源性較高,屬于經(jīng)典毒株;TJ-S1株、TJ-S2株和國內(nèi)分離株SD-14株、HuN株Nsp2基因同源性較高,在第221位和第272位～300位氨基酸發(fā)生缺失,屬于變異毒株。以上研究結(jié)果表明,PRRSV的N sp2基因的變異廣泛存在,在同一地區(qū)PRRSV變異毒株和經(jīng)典毒株可以同時(shí)存在;PRRSV經(jīng)典毒株感染亦可導(dǎo)致豬的高熱病,說明Nsp2基因的缺失變異并不是PRRSV的致病力和毒力變化的惟一因素或主要因素,PRRSV的致病力和毒力的改變可能是多區(qū)域多因素作用的結(jié)果。

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