段博芳,沈艷萍,楊貴樹,張 飛,吳靜敏,段 綱,尹革芬*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,云南昆明 650201;2.振太畜牧獸醫(yī)站,云南鎮(zhèn)沅 666508)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine productive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的以母豬繁殖障礙和仔豬呼吸衰竭為主要癥狀的傳染病,臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬流產(chǎn)、早產(chǎn)、產(chǎn)死胎、產(chǎn)木乃伊胎、仔豬成活率下降和育成豬呼吸道癥狀等[1]。PPRS于1987年在美國北卡羅來納州首先發(fā)現(xiàn)[2],隨后在荷蘭、加拿大、德州、英國、西班牙、瑞士、法國等世界許多國家和地區(qū)均有發(fā)生[3]。1991年Wensvoort G等[4]用豬巨噬細(xì)胞(PAM)從發(fā)病豬群中分離到PRRSV(歐洲型)。1996年郭寶清等[5]用 PAM 和Marc-145細(xì)胞首次從國內(nèi)發(fā)病豬群中分離出PRRSV,隨后我國的許多省都相繼用肺泡巨噬細(xì)胞(pulmonary alveolar macrophage,PAM)和Marc-145細(xì)胞分離到PRRSV毒株。自2007年以來,我國有26個省份先后發(fā)生了高致病性PRRS疫情,對我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了極大的危害和重大的經(jīng)濟損失,嚴(yán)重影響了農(nóng)民的增收和豬肉消費市場的穩(wěn)定以及養(yǎng)豬業(yè)的生產(chǎn)安全。2007年楊貴樹等對云南省某些豬場PRRS血清流行病調(diào)查表明 PRRS血清陽性率為90.8%[6]。表明PRRS已經(jīng)在云南省存在,本試驗從云南某豬場送檢樣品(病死豬肺)中分離出一株疑是PRRSV,并對其進(jìn)行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源 云南某豬場送檢樣品,經(jīng) RTPCR初步檢測為PRRSV陽性。

1.1.2 細(xì)胞及相關(guān)試劑 Marc-145細(xì)胞由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物醫(yī)學(xué)實驗室保存;原代PAM細(xì)胞為自行分離;MEM粉劑(GIBiCO);1640細(xì)胞培養(yǎng)液(GIBCO);標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清,天津瀕洋生物公司產(chǎn)口;雙抗,美國GIBCO公司;胰酶粉,T ryPSIn:1:250,華美生物工程公司產(chǎn)品;血樣(液體樣本)RNA提取試劑盒,百泰克生物有限公司產(chǎn)品;反轉(zhuǎn)錄試劑盒,TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 病料的處理 按參考文獻(xiàn)[7]方法操作,采集發(fā)病豬的肺臟,勻漿器研磨后用無血清的MEM制成懸液,凍融3次,2 500 r/min離心15 min取上清,濾網(wǎng)過濾后,0.22 μ m微孔濾膜過濾除菌。置-20℃冰箱保存,作為接種用。

1.2.2 細(xì)胞制備

1.2.2.1 Marc-145單層細(xì)胞的制備 Marc-145細(xì)胞自液氮罐中取出后,迅速置于37℃水浴中快速晃動,使細(xì)胞在2 min內(nèi)很快融化,移入細(xì)胞培養(yǎng)皿中。加入含100 mL/L FBS和1/100雙抗的MEM營養(yǎng)液,置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),12 h后換液。在隨后的培養(yǎng)過程中,觀察細(xì)胞生長情況,長成單層后進(jìn)行傳代接種。

1.2.2.2 原代PAM的制備 豬臂動脈叢放血致死,剖開胸腔,結(jié)扎氣管后連同心臟取出完整的肺,去心臟及周圍脂肪等組織后,用無菌生理鹽水充分漂洗肺表面,除凈血塊污物。從氣管往肺部注入滅菌的PBS液40 mL,輕輕拍打肺表面,2 min后回收灌洗液。重復(fù)以上操作,直到共回收約200 mL。將回收的支氣管肺泡灌洗液用吸管輕輕吹打,使其細(xì)胞團以及黏液塊分散,用無菌的100目不銹鋼篩過濾,收集全部灌洗液,1 500 r/min離心10 min,棄上清。用無菌PBS重懸細(xì)胞沉淀,200目濾網(wǎng)過濾,1 500 r/min離心10 min,棄上清。得到細(xì)胞沉淀后按原代單層細(xì)胞培養(yǎng)法[8]進(jìn)行培養(yǎng),觀察細(xì)胞生長情況,長成單層后進(jìn)行接毒。

1.2.3 病毒的分離 按照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。將處理的病料接種于長成單層的M-145細(xì)胞和PAM細(xì)胞,每瓶1.5 mL;37℃吸附1 h后加入含有50 mL/L血清的培養(yǎng)液。每天觀察細(xì)胞病變(CPE)情況,當(dāng)病變至70%～80%收毒,未出現(xiàn)CPE者,經(jīng)反復(fù)凍融3次后取上清盲傳3代。

1.2.4 病毒的電鏡觀察 將分離毒經(jīng)高速離心濃縮后送電鏡室進(jìn)行電鏡觀察。

1.2.5 RT-PCR鑒定 按照引物設(shè)計原則,參照CH-1a株篩選設(shè)計一對引物(p1、p5),該對引物可擴增PRRSV的ORF7特異性片段,其長度為329 bp。p1、p5 的 序列 分 別為 :P1 5′-AATGGCCAGCCAGTCAATCA-3′;P5 5′-TCATGCTGAGGGTGATGCTG-3′

1.2.5.1 培養(yǎng)物中RNA的提取 提取方法按血樣(液體樣本)RNA提取試劑盒說明書操作。

1.2.5.2 反轉(zhuǎn)錄 按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行。RT過程中體系的配制需在冰盒上進(jìn)行;戴手套防止RNA酶污染。

1.2.5.3 PCR反應(yīng)體系和條件 PCR反應(yīng)在25 μ L反應(yīng)體系中進(jìn)行,依次加入以下成分:ddH2O 18 μ L,10 ×PCR buffer 2.5 μ L,dNTP Mixture(2.5 mmol/L)1 μ L,正 反 方 向 引 物 各 0.5 μ L(10 pmol/μ L),0.5 U Taq 酶,模板 2 μ L,混勻短暫離心后置PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)程序為:94℃預(yù)變性3 min;94℃30 s,58℃30 s,72℃30 s,30個循環(huán);72℃延伸 5 min;4℃保存。用10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳(120 V,30 min),觀察擴增結(jié)果。

1.2.6 動物回歸試驗 參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行,將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后離心取上清,于P2級動物房里,將上清液接種到經(jīng)RT-PCR檢測PRRSV陰性,血清學(xué)檢測PRV、CSFV抗體陽性的斷奶仔豬。每日觀察臨床癥狀,并記錄體溫。定期采血測抗體效價和RT-PCR檢測病毒。

1.2.7 間接免疫熒光試驗鑒定 試驗步驟按參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行,被檢標(biāo)本上滴加一抗為PRRSV陽性抗體,二抗為FIFC標(biāo)記的羊抗兔IgG。自然干燥后滴加500 mL/L甘油,待干燥后。置于熒光顯微鏡下觀察。

1.2.8 病毒毒價測定(TCID50)參照文獻(xiàn)[7]方法進(jìn)行,取已長滿的細(xì)胞,經(jīng)消化后計數(shù)至1.5×105個/mL,于 96孔培養(yǎng)板中,每孔加入細(xì)胞懸液100 μ L,置 37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為 5%的 CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。病毒液做從10-1～10-10梯度稀釋,接種到已長成單層的96孔板中,每一稀釋度設(shè)8個重復(fù),每孔接種50 μ L,設(shè) 16個孔為正常對照。置37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天早晚各觀察1次,觀察有無細(xì)胞病變,逐日觀察并記錄結(jié)果,一般需要觀察5 d～7 d。結(jié)果按 Reed-Muench兩氏法計算。

1.2.9 理化測定 理化特性檢驗分離病毒株,TCID50滴定方法測定對氯仿、紫外線、pH、熱的敏感性。試驗方法按參考文獻(xiàn)[7]進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng)觀察

本試驗采用Marc-145和PAM兩種細(xì)胞對病料進(jìn)行分離培養(yǎng)。病料在Marc-145細(xì)胞經(jīng)盲傳2代～3代后,培養(yǎng)48 h～72 h后可見CPE(圖1)。連續(xù)傳6代后,CPE出現(xiàn)時間穩(wěn)定,表現(xiàn)為細(xì)胞變圓,折光性降低,灶狀脫落,呈現(xiàn)大面積空洞。在PAM細(xì)胞上接毒后72 h細(xì)胞開始出現(xiàn)CPE,表現(xiàn)為細(xì)胞堆積,折光性降低(圖2)。

圖1 病毒在Marc-145細(xì)胞上的增殖Fig.1 Virus proliferation in M arc-145 cells

圖2 病毒在PAM細(xì)胞上的增殖Fig.2 Virus proliferation in the PAM cells

2.2 病毒的電鏡觀察

1∶40 000電鏡下可觀察到大小為45 nm～55 nm左右的病毒粒子(圖3)。

2.3 RT-PCR檢測

在細(xì)胞出現(xiàn)明顯CPE后,提取細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR檢測PRRSV,所得結(jié)果為陽性(圖4)。

圖3 電鏡下病毒粒子Fig.3 Virions under electron microscope

2.4 動物接種試驗

將出現(xiàn)CPE的細(xì)胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后離心取上清,接種到1月齡PRRSV陰性的仔豬。在接種后1周沒出現(xiàn)異常癥狀,采血測抗體效價1∶40,RT-PCR未檢測到病毒。接種2周后仔豬出現(xiàn)體溫升高,呼吸急促,并伴有食欲廢絕,精神不振等癥狀,測抗體效價1∶20,RT-PCR能在豬血液中檢測到PRRSV(圖 5)。

圖4 細(xì)胞培養(yǎng)物RT-PCR擴增結(jié)果Fig.4 RT-PCR results of cell culture product

圖5 接種豬血液樣品RT-PCR擴增結(jié)果Fig.5 RT-PCR results of infected porcine blood sample

2.5 間接免疫熒光鑒定

熒光顯微鏡下觀察玻片,在接種Marc-145細(xì)胞的胞漿內(nèi)出現(xiàn)黃綠色熒光:未接種的Marc-145細(xì)胞沒有見到熒光(圖6)。

圖6 間接免疫熒光試驗鑒定病毒Fig.6 Detection of P RRSV in infected Marc-145 cells by IFA

2.6 病毒毒價測定(TCID50)經(jīng)測定

該分離株病毒的 TCID50為10-4.75/0.1 mL培養(yǎng)物。

2.7 主要理化特性測定

分離的毒株經(jīng)終濃度48 mL/L氯仿4℃震蕩10 min處理后失活;經(jīng)紫外照射(室溫30 min)處理后被滅活;經(jīng)37℃水浴48 h或56℃水浴45 min后病毒完全失活;病毒經(jīng)pH 5.0以下或pH 7.5以上在4℃的液體中作用2 h,病毒失活。結(jié)果表明,該分離到的病毒對氯仿、紫外線、熱、酸堿敏感。

3 討論

本試驗將CPE明顯的細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)高速離心濃縮后經(jīng)電鏡觀察鑒定病毒粒子形態(tài),電鏡下看到了直徑約為45 nm～55nm的圓形顆粒,這與國內(nèi)相關(guān)報道相似[9]。研究表明[10-11],不同的 PRRSV毒株對細(xì)胞的嗜性也不同。無論體內(nèi)或體外培養(yǎng),PRRSV均可在單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)(包括肺泡巨噬細(xì)胞PAM、外周單核細(xì)胞、肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞等)中復(fù)制,但更偏愛在PAM細(xì)胞上復(fù)制,其產(chǎn)毒量和毒價都較高。在體內(nèi),所有毒株對PAM的親嗜性最高;在體外,歐洲分離株(LV)僅能適應(yīng)于豬肺巨噬細(xì)胞(PAM),并有致細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE),美洲分離株除了能在PAM細(xì)胞上很好的增殖并產(chǎn)生CPE外,還可在 CL2621、Marc-145、MA-104細(xì)胞系培養(yǎng),并能出現(xiàn)CPE。本試驗所分離的 YN-1病毒株除能在PAM細(xì)胞上很好增殖并產(chǎn)生CPE外,還能在Marc-145細(xì)胞上增殖且產(chǎn)生CPE。表明所分離毒株為美洲株。

雖然尚未發(fā)現(xiàn)PRRSV有不同的血清型,但來源于不同地理位置的毒株之間的變異程度很大且流行過程中容易發(fā)生變異,因此不同毒株之間也存在著毒力以及抗原性的差異[7,11]。吳家強等[12]研究表明,當(dāng)培養(yǎng)液pH在7.0～7.2范圍時,細(xì)胞密度在10×l04～15×l04個/mL范圍內(nèi),用含 80 mL/L血清的維持液,獲得的病毒高滴度是107.32～107.36TCID50/mL;而在相同條件下,嚴(yán)亞賢等[13]報道,上海分離株SH1株病毒,毒價為1×105.9TCID50/mL。而本研究試驗得出,細(xì)胞培養(yǎng)液pH在7.0～7.4范圍內(nèi),細(xì)胞密度在4×104～5×104個/mL范圍內(nèi),用含20 mL/L血清的維持液培養(yǎng),病毒在Marc-145細(xì)胞上增殖產(chǎn)生CPE最明顯,TCID50較穩(wěn)定,其毒價為10-4.75/0.1 mL,所分離獲得的云南PRRSV分離株為中等毒力毒株。從毒價來看,分離株與國內(nèi)不同地區(qū)分離株之間存在差異。成功分離獲得的PRRSV YN-1株將為進(jìn)一步開展云南省PRRSV感染機制及病原生物學(xué)相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

[1]Benfield D A,Nelson E,Collins J E,et al.Characterization of swine infertility and respiratory syndrome(SIRS)virus(isolate A TCC VR-2332)[J].Vet Diagn Inves,1992,(4):127-133.

[2]Zhang Y,Shamra R D,Paul P S.MnocoInoal antibodies against confomratinoally dsepndent epeitoeps on porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].Vet Microbiol,1998,63(2-4):125-136.

[3]Shimizu M,Yamada S,Miy M R,et al.Isolation of swine infertility and respiratory syndrome virus from Heko-heko disease of pig s[J].J Vet Met Sci,1994(6):389-391.

[4]Wensvoort G,Terpstra C,PoI J M A,et al.M ystery swine disease in the Netherlands:the isolation of Lely stad virus[J].Vet Q,1991,13(3):121-130.

[5]郭寶清,陳章水.剌文興,等.應(yīng)用間接熒光法從國內(nèi)生殖障礙綜合征豬群中檢測生殖和呼吸綜合征用性抗體的研究[J].中國獸醫(yī)科技,1996(3):3-5.

[6]楊貴樹,劉 杰,王愛茹.云南省藍(lán)耳病血清流行病學(xué)調(diào)查[J].畜禽業(yè),2007(219):28-29.

[7]殷 震,劉景華.動物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:619-620.

[8]辛 華.現(xiàn)代細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,2008:126-128.

[9]程安春,汪銘書,希尼尼根,等.豬繁殖與呼吸綜合癥病毒四川株分離、鑒定及其病原特性研究[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2004(9):15-18.

[10]劉伍海,汪銘書,程按春,等.PRRSV感染Marc-145細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察[J].黑龍江畜牧獸醫(yī),2008(3):61-63.

[11]Hanada K,Suzuki Y,Nakane T.T he origin and evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome viruses[J].M ol Biol and Evolut,2005(22):1024-1031.

[12]吳家強,顏世敢,胡北俠,等.細(xì)胞培養(yǎng)對PRRSV-SD分離株滴度的影響[J].山東農(nóng)業(yè)科學(xué),2002(6):41-42.

[13]嚴(yán)亞賢,孫建和,王恒安,等.豬繁殖-呼吸綜合征病毒上海分離株的病毒特性研究[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2001,24(2):90-93.