程家林,李國清,岳彩鈴,徐前明,高振永,劉 霞

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,廣東廣州 510642)

環(huán)孢子蟲(Cyclospora sp.)是一種新出現(xiàn)的食源性和水源性傳播的寄生原蟲,可以引起人和動物的胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉[1-5]。1996年-1999年美國和加拿大相繼暴發(fā)了大規(guī)模的食源性環(huán)孢子蟲病[1,6],由此該寄生蟲引起醫(yī)學(xué)界和國家公共衛(wèi)生機構(gòu)的廣泛關(guān)注。大量研究證實環(huán)孢子蟲隸屬于復(fù)頂門、孢子蟲綱、真球蟲目、艾美耳科、環(huán)孢子蟲屬(Cyclospora)。迄今為止,已報道的環(huán)孢子蟲大約有18種[7-8],它們大都寄生于哺乳類與爬行類,分別為C.cayetanensis、C.cercopitheci、C.colobi、C.papionis、C.angimurinensis、C.ashtabulensis、C.b abaulti、C.caryolytica 、C.glomericola 、C.megacephali、C.niniae、C.parascalopi、C.scinci、C.talpea 、C.tropidonoti、C.viperae、C.zamenis 和牛源環(huán) 孢子 蟲 。由于各種環(huán)孢子蟲的形態(tài)學(xué)特征基本相似,并容易與其他球蟲相混,要確定環(huán)孢子蟲的種類,必需對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。目前對環(huán)孢子蟲的分子鑒定方法國際上多采用Relman D A等[9]設(shè)計的套式引物,擴增18 S rDNA基因的294 bp片段,隨后進(jìn)行RFLP研究或?qū)ζ淇寺y序結(jié)果進(jìn)行序列分析[10],來確立環(huán)孢子蟲屬的分類地位;擴增環(huán)孢子蟲種間高度特異的轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)Ⅰ(internal transcribed spacer 1,ITS-1)基因片段,來確立環(huán)孢子蟲種的分類地位。迄今為止,通過分子生物學(xué)研究鑒定出的環(huán)孢子蟲有 5種[7-9],分別為 C.cayetanensis、C.cercopitheci、C.colobi、C.papionis和牛源環(huán)孢子蟲。本研究首次在鴨糞中發(fā)現(xiàn)了疑似環(huán)孢子蟲卵囊,并綜合應(yīng)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定方法對其進(jìn)行分類研究,以確立鴨源環(huán)孢子蟲的分類地位。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 卵囊的收集 從廣東省佛山某鴨場采集新鮮鴨糞,先加少量水稀釋,鏡檢發(fā)現(xiàn)有疑似環(huán)孢子蟲卵囊時,再用多于10倍體積的水稀釋全部糞樣并充分?jǐn)嚢杌靹蚝?依次經(jīng) 80、100、160目銅篩過濾,沉淀過夜;然后小心去除上清液,離心沉淀后,用飽和蔗糖漂浮法濃集疑似環(huán)孢子蟲卵囊;最后將收集的卵囊經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后,置于4℃冰箱備用。

1.1.2 主要試劑 糞樣DNA提取試劑盒為OMEGA公司產(chǎn)品;蛋白酶 K、瓊脂糖、Ex-Taq酶、PCR buffer、MgC12、dNT Ps、pMD-18T 載體均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;DNA純化試劑盒為上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司產(chǎn)品;WizardTMplus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒為Promega公司產(chǎn)品;飽和蔗糖和感受態(tài)細(xì)胞JM109為華南農(nóng)業(yè)大學(xué)寄生蟲與寄生蟲病學(xué)教研室自制。

1.2 方法

1.2.1 卵囊的形態(tài)學(xué)鑒定 對濃集后的疑似環(huán)孢子蟲卵囊進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定,包括400倍下普通鏡檢,改良抗酸染色后觀察以及孢子化試驗,將其鏡檢結(jié)果與文獻(xiàn)[3,7-8]描述的典型特征進(jìn)行比較。其鏡檢典型特征為:直接涂片時可見卵囊大小約為8.0 μ m～10 μ m,其內(nèi)含折光性較強的成團(tuán)小球體,呈桑椹胚狀,淡綠色;孢子化后卵囊有兩個孢子囊,每個孢子囊有兩個子孢子;經(jīng)改良抗酸染色卵囊著色不均,呈深紅色或淡紅色或不著色。

1.2.2 DNA提取 按照OMEGA公司的糞樣DNA提取試劑盒的說明,提取本次純化卵囊的基因組DNA,并做相應(yīng)改進(jìn)。一是玻璃珠震蕩的時間宜延長至30 min以上,以便打碎卵囊壁;二是消化時間延長,最好消化過夜;三是DNA提取最后一步加入Elution buffer的量應(yīng)根據(jù)卵囊的多少適量加入,一般要小于說明書的加入量60 μ L。

1.2.3 18 S rDNA基因的套式PCR擴增 參考Relman P A等[9]設(shè)計的引物擴增18 S rDNA基因片段,兩對引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成,預(yù)計片段大小為294 bp。PCR擴增在0.5 mL eppendorf管中依 次加入 5 μ L 10×buffer(含25 mmol/L MgC12),4 μ L dNTPs,正反 向引 物各1 μ L(25 pmol/μ L), 模 板 DNA 2 μ L, 最 后 加Ex-Taq酶0.25 μ L,用滅菌去離子雙蒸水加至總體積為50 μ L,混勻后在PCR擴增儀上擴增。反應(yīng)參數(shù)為:94℃5 min;94℃30 s,外引物51℃30 s,內(nèi)引物48℃退火30 s,72℃延伸1 min,循環(huán)35次;最后72℃后延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析,于紫外透射儀上觀察并記錄結(jié)果。

1.2.4 ITS-1+基因的PCR擴增 分析GenBank中收錄的環(huán)孢子蟲rDNA的18 S、5.8 S序列,采用引物設(shè)計軟件Premier 5.0在其保守位置設(shè)計一對引物用來擴增ITS-1+序列(包括部分18 S rDNA,全長 ITS-1及部分 5.8 S rDNA序列)。引物為ITS-R,5′-AGGGTCCTGTGAACTCAT-3′;ITS-F,5′-ACTGAAACAGACGTGCTG-3′。預(yù) 計擴 增片段大小約680 bp。

PCR擴增體系參照套式PCR擴增體系,混勻后在PCR擴增儀上擴增。反應(yīng)參數(shù)為:94℃5 min;94℃30 s,47℃30 s,72℃1 min,循環(huán)35次;最后72℃10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 PCR產(chǎn)物的克隆和測序 按照DNA膠回收試劑盒進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化,并將其連接到pMD-18-T載體上,然后轉(zhuǎn)入JM109感受態(tài)細(xì)胞中,進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。挑取轉(zhuǎn)化的白色菌落,接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取重組菌1 μ L做模板,用相應(yīng)引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。選菌落PCR陽性克隆菌株,用Promega公司的WizardTMplus SV Minipreps DNA Purification System試劑盒抽提重組質(zhì)粒,再用PstⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定。將鑒定為陽性的重組菌樣送上海博尚生物技術(shù)有限公司測序。

1.2.6 序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析 進(jìn)入美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)站點,利用“Nucleotide-nucleotide BLAST”程序,將此次所測序列與GenBank中已知的各種微生物序列進(jìn)行相似性搜索,尋找同源性核苷酸序列,并下載相關(guān)序列,用MEGA 4軟件進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,確定其種類。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果

鴨源環(huán)孢子蟲鏡檢結(jié)果見圖1。卵囊為正圓形,大小約為 8.0 μ m ～10 μ m。未孢子化卵囊內(nèi)有顆粒狀小體,呈桑椹狀、淡綠色;孢子化卵囊內(nèi)有兩個孢子囊;經(jīng)改良抗酸染色后,卵囊呈紅色,有著色不均的現(xiàn)象。

圖1 鴨源環(huán)孢子蟲卵囊形態(tài)圖(400×)Fig.1 M orphology of Cyclospora-like oocysts from duck(400×)

2.2 PCR擴增結(jié)果

以提取的鴨源環(huán)孢子蟲基因組為模板,分別擴增其18 S rDNA和ITS-1+基因,其電泳結(jié)果如圖2和圖3所示,擴增片段的大小與預(yù)期片段大小基本相同。

圖2 18 S rDNA基因套式PCR擴增結(jié)果Fig.2 The results of 18 S rDNA gene amplified by nested PCR

圖3 ITS-1+基因 PCR擴增結(jié)果 Fig.3 The results of ITS-1+gene amplified by PCR

2.3 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定

取重組菌1 μ L做模板,用相應(yīng)引物進(jìn)行菌落PCR鑒定。選菌落PCR陽性克隆菌株,進(jìn)行質(zhì)粒小量抽提,所得重組質(zhì)粒用PstⅠ和SacⅠ進(jìn)行雙酶切后,經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳,結(jié)果見圖4和圖5,均切出兩條條帶,都含有目的條帶,與相應(yīng)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果相符。

圖5 ITS-1+基因重組質(zhì)粒PstⅠ和SacⅠ雙酶切鑒定 Fig.5 The identification of the ITS-1+gene recombinant plasmids by restriction digestion with PstⅠand SacⅠ

2.4 測序及序列分析結(jié)果

本次測得的18 S rDNA部分基因片段大小為294 bp,其組成如下:

利用NCBI在線BLAST程序,對本次所測的18 S rDNA基因序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)與環(huán)孢子蟲和艾美耳科原蟲有較高的相似性,其中與C.cayetanensis相似性為98%。從GenBank中下載相關(guān)序列,用MEGA4軟件建立系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖6)。由進(jìn)化樹分析可知,本研究分離出的環(huán)孢子蟲和艾美耳科的球蟲遺傳距離較近,尤其是和其他環(huán)孢子蟲關(guān)系最近,符合環(huán)孢子蟲屬的分類標(biāo)準(zhǔn)。

圖6 鴨源環(huán)孢子蟲18 S rDNA基因的系統(tǒng)進(jìn)化樹(N-J法)Fig.6 The phy logenetic tree of cy clospora-like organism from duck based on 18S rDNA gene(N-J method)

本次測得的ITS-1+基因片段大小為668 bp,包括部分18 S rDNA(135 bp),全部 ITS-1(374 bp),部分5.8 S rDNA(159 bp),其組成如下:

對種間高度特異的ITS-1序列進(jìn)行同源性分析,通過NCBI中的 BLAST在線分析,與GenBank收錄的所有已知序列進(jìn)行同源性比較。結(jié)果顯示,該序列高度特異,未發(fā)現(xiàn)同源性基因片段。因此,鴨源環(huán)孢子蟲的分類地位得到確立,本研究首次發(fā)現(xiàn)了鴨源環(huán)孢子蟲。

3 討論

環(huán)孢子蟲作為一種新出現(xiàn)的寄生性原蟲,近年來,其流行病學(xué)調(diào)查和未知宿主的探索研究倍受關(guān)注。本研究在鴨糞中發(fā)現(xiàn)的疑似環(huán)孢子蟲卵囊,通過形態(tài)學(xué)鑒定,其形態(tài)特征與國內(nèi)外報道的人源環(huán)孢子蟲(C.cayetanensis)的形態(tài)特征基本一致。

要確立其為環(huán)孢子蟲,必需進(jìn)一步對其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。由于18 S rDNA基因在生物進(jìn)化過程中具有高度保守性,近年來國外學(xué)者應(yīng)用18 S rDNA基因序列設(shè)計引物,來鑒別和檢測環(huán)孢子蟲[7-14],目前已測得18 S rDNA基因序列的環(huán)孢子蟲 有 C.cayetanensis、C.cercopitheci、C.colobi、C.papionis和牛源環(huán)孢子蟲[7-9]。Eberhard M L等[15]對 C.cercopitheci、C.colobi、C.papionis 進(jìn)行 18 S rDNA序列比對時發(fā)現(xiàn)環(huán)孢子蟲屬內(nèi)高度同源,若要進(jìn)行種間區(qū)別,需要尋找其他高變區(qū)。Adam RD等[16]和Olivier C等[17]建議可用ITS-1區(qū),Olivier研究發(fā)現(xiàn)C.cayetanensis與C.papionis的ITS-1區(qū)高度特異;Adam研究發(fā)現(xiàn)從不同地方分離到的C.cayetanensis的ITS-1區(qū)基本相同,沒有因地域來源不同而呈現(xiàn)差異;肖淑敏等[18]曾用ITS-1+序列鑒定牛源環(huán)孢子蟲。應(yīng)用Relman D A等[9]設(shè)計的套式引物和自己設(shè)計的一對引物,擴增了18 S rDNA基因的部分片段和ITS-1基因全部片段,并對其克隆測序結(jié)果進(jìn)行了序列分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn),該蟲的18 S rDNA基因序列與環(huán)孢子蟲的相應(yīng)基因序列相似性高達(dá)98%,而且系統(tǒng)進(jìn)化樹中它們又位于同一分支,該蟲的ITS-1基因序列高度特異,在GenBank中未發(fā)現(xiàn)同源序列,進(jìn)而確立了鴨源環(huán)孢子蟲種的分類地位。

[1]Chambers J,Somerfeldt S,M ackey L,et al.Outbreaks of Cyclospora cayetanensis infection-United States[J].MMWR,1996,45(25):549-551.

[2]Serpentini A,Dutoit E,Camus D.Cyclospora cayetanensis:review of an emerging intestinal pathogen[J].Annales De Biologie Clinique,1999,57(6):677-683.

[3]Mansfield L S,Gajadhar A A.Cyclospora cayetanensis,a food-and waterborne coccidian parasite[J].Vet Parasitol,2004,126(1-2):73-90.

[4]Popovici I,Dahorea C,Rugina A,et al.Acute diarrhea associated with Cyclospora cayetanensis[J].Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi,2003,107(4):877-880.

[5]Naito T,Mizue S,Misawa S,et al.Cyclospora infection in an immunocompetent patient in Japan[J].Jpn J Infect Dis,2009,62(1):57-58.

[6]Herwaldt B L.Cyclospora cayetanensis:a review,focusing on the outbreaks of cyclosporiasis in the 1990s[J].Clin Infect Dis,2000,31(4):1040-1057.

[7]Joan M S,Betty H O.Cyclospora cayetanensis:a review of an emerging parasitic coccidian[J].Int J Parasitol,2003,33(4):371-391.

[8]肖淑敏,李國清,周榮瓊,等.牛源環(huán)孢子蟲的發(fā)現(xiàn)與分子鑒定[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報,2006,28(4):380-382.

[9]Relman D A,Schmidt T M,Gajadhar A,et al.M olecular Phylogenetic analy sis of Cyclospora,the human intestinal pathogen,suggest that it is closely related to Eimeria species[J].J Infect Dis,1996,173(32):440-444.

[10]Orlandi P A,Carter L,Brinker A M,et al.Targeting singlenucleotide polymorphisms in the 18S rRNA gene to differentiate Cyclospora species from Eimeria species by multiplex PCR[J].Appl Environ Microbiol,2003,68(8):4806-4813.

[11]Marina S,Scott U,Joseph O.Sensitivity of PCR detection of Cyclospora cayetanensis in raspberries,basil,and mesclun lettuce[J].J Microbiol Meth,2003,54(1):277-280.

[12]徐前明,李國清.環(huán)孢子蟲的研究進(jìn)展[J].寄生蟲與醫(yī)學(xué)昆蟲學(xué)報,2008,15(1):55-60.

[13]李韋華,李國清,肖淑敏,等.牛源環(huán)孢子蟲18 S rDNA部分序列的擴增與克隆分析[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2006,27(12):62-65.

[14]Joan M S,Betty H O.PCR-restriction fragment leng th polymorphism method for detection of Cyclospora cayetanensis in environmental waters without microscopic confirmation[J].Appl Environ Microbiol,2003,69(8):4662-4669.

[15]Eberhard M L,da Silva A J,Lilley B G,et al.Morphologic and molecular characterization of new Cyclospora species from Ethiopian monkey s:C.Cercopitheci sp.n.,C.colobi sp.n.,and C.papionis sp.n.[J].Emerg Infect Dis,1999,5(5):651-658.

[16]Adam R D,Ortega Y R,Gilman R H,et al.Intervening transcribed spacer region 1 variability in Cyclospora cayetanensis[J].Clin Microbiol,2000,38(6):2339-2343.

[17]Olivier C,van de Pas S,Lepp P W,et al.Sequence variability in the first internal transcribed spacer region within and among Cyclospora species is consistent with poly parasitism[J].Int J Parasitol,2001,31(13):1475-1487.

[18]肖淑敏,李國清,周榮瓊,等.以 ITS-1+序列鑒定牛源環(huán)孢子蟲[J].中國獸醫(yī)學(xué)報,2007,27(1):59-65.