宋 俊 洲, 安 家 彥

( 大連工業(yè)大學 生物與食品工程學院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

麥芽是釀造啤酒的重要原料，目前我國的啤酒產(chǎn)量在不斷增長，而高質量的釀造大麥卻長期依賴進口，研發(fā)新的國產(chǎn)大麥品種和探索麥芽的生產(chǎn)工藝成為現(xiàn)實需要。大麥發(fā)芽的目的是使麥粒生成大量的各種酶，部分非活化的酶得到活化，使大麥適度溶解。已有研究表明，大麥顆粒吸收水分，呼吸作用加強，內(nèi)部發(fā)生一系列的生理生化變化，這些變化都是在酶的參與下完成的。其中，α-淀粉酶的變化較為明顯[1]。在制麥工業(yè)中，α-淀粉酶活性的高低對麥芽的溶解程度有一定的影響，只有α-淀粉酶可以降解完整的淀粉顆粒[2]。這些報道多側重于大麥中酶性質的研究。α-淀粉酶的質和量取決于大麥的品種和制麥工藝條件的控制，本文以響應曲面分析法[3]，以α-淀粉酶的活力為依據(jù)，應用于大麥發(fā)芽條件的工藝優(yōu)化中。通過實驗，建立了發(fā)芽條件工藝參數(shù)與α-淀粉酶活力之間的數(shù)學模型，優(yōu)化了國產(chǎn)甘啤4號大麥發(fā)芽的工藝參數(shù)，為制麥生產(chǎn)等提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

1.1.1 材 料

供試大麥，國產(chǎn)甘啤4號大麥，由大連中糧麥芽有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

可溶性淀粉，麥芽糖，檸檬酸，檸檬酸鈉，3,5-二硝基水楊酸，酒石酸鉀鈉，苯酚，氫氧化鈉，亞硫酸鈉，均為分析純。

1.2 主要儀器

HH-B11.600-S型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；HH型恒溫水浴鍋，江蘇南通竹行電熱器廠；GZX-DH-50X55型電熱恒溫干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械廠；JYL-350型料理機，山東九陽小家電有限公司；721型分光光度計，上海第三分析儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 麥芽制備

在14 ℃下，采用浸水4 h斷水6 h的方式浸麥，通過控制浸麥時間，監(jiān)測含水率，使浸麥度達到一定值，然后取出大麥進入發(fā)芽階段，控制濕度90%以上，分別在不同溫度條件下發(fā)芽，取不同時間的發(fā)芽大麥于50 ℃干燥24 h，備用。

1.3.2 酶液制備

取1 g麥芽碎樣放入三角瓶中，加入蒸餾水100 mL，放入40 ℃水浴鍋中定時攪拌，保溫1 h后，用雙層濾紙過濾，棄去開始濾液20 mL，以后濾液留測用。

1.3.3 含水率的測定

采用恒重法[4]。

1.3.4α-淀粉酶活力的測定

DNS比色法[5]，標準曲線用麥芽糖制作。

2 結果與討論

2.1 α-淀粉酶活力的單因素試驗

2.1.1 發(fā)芽時間對α-淀粉酶活力的影響

α-淀粉酶是一種內(nèi)切酶，可以在淀粉鏈的任意處水解α-1,4-葡萄糖苷鍵，未經(jīng)過發(fā)芽的原大麥中不含或很少含有α-淀粉酶。圖1表示其他條件不變(發(fā)芽溫度為16 ℃、浸麥度為45.4%)，發(fā)芽時間對α-淀粉酶活力的影響。由圖1可知，大麥萌發(fā)開始時α-淀粉酶活力很低,隨著發(fā)芽時間的延長，α-淀粉酶活力保持增大，96 h附近達到較大值，之后有所降低，并基本保持不變。這是由于發(fā)芽過程初期大麥胚部合成大量赤霉素，并分泌到糊粉層，誘導編碼α-淀粉酶的mRNA大量合成，來誘導α-淀粉酶的合成[6-7]，特別是從發(fā)芽大約48 h,酶活迅速開始上升，當赤霉素含量減少時mRNA則不積累，這是發(fā)芽后期酶活力降低的原因之一，α-淀粉酶活力的下降可能與發(fā)芽時間過長，底物含量減少，大麥的呼吸作用減弱有關。

圖1 α-淀粉酶活力隨大麥發(fā)芽時間的變化

Fig.1 Changes ofα-amylase activity accorded with the different germinating time of barley

2.1.2 發(fā)芽溫度對α-淀粉酶活力的影響

圖2表示其他條件不變(發(fā)芽時間為96 h、浸麥度為45.4%)，不同發(fā)芽溫度對α-淀粉酶活力的影響。由圖2可知，溫度低時，α-淀粉酶的形成較慢，需要延長發(fā)芽時間才能獲得較高酶活，溫度較高利于α-淀粉酶的快速形成，16 ℃左右酶活力最高，溫度過高加快了大麥的發(fā)芽和呼吸作用，但是不利于最大酶活值的形成。

圖2 α-淀粉酶活力隨大麥發(fā)芽溫度的變化

Fig.2 Changes ofα-amylase activity accorded with the different germinating temperature of barley

2.1.3 浸麥度對α-淀粉酶活力的影響

要使大麥中的α-淀粉酶高效積累和迅速的激活，大麥中必須要有適宜的水分含量。含水率太低時大麥不能發(fā)芽，為了使大麥的胚乳能夠適當?shù)厝芙?，就要提高浸麥度。圖3表示其他條件不變(發(fā)芽時間為96 h、發(fā)芽溫度為16 ℃)，不同浸麥度對α-淀粉酶活力的影響。由圖3可知，隨著浸麥度的提高，由于大麥的代謝速度、吸收氧氣以及釋放二氧化碳的速度都會增加，α-淀粉酶活力也隨之提高，含水率在46%左右酶活力較高，但含水率過高，不利于大麥的正常呼吸和代謝，阻礙了酶的形成。

圖3 α-淀粉酶活力隨大麥浸麥度的變化

Fig.3 Changes ofα-amylase activity accorded with the different water content of barley

2.2 響應面法對大麥發(fā)芽條件的優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，以α-淀粉酶活力為響應值，運用Minitab15數(shù)據(jù)處理軟件進行響應曲面分析(response surface analysis, RSA)，對發(fā)芽條件優(yōu)化。響應面設計因素水平設計見表1，回應面分析試驗結果見表2。

表1 響應面設計因素與水平

表2 回應面分析試驗結果

對試驗數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，以α-淀粉酶活(Y)為因變量，發(fā)芽溫度(X1)、發(fā)芽時間(X2)和浸麥度(X3)為自變量建立回歸方程為

Y=55.97+3.54X1+3.06X2+1.01X3-

14.06X12-6.00X22-2.82X32-

4.13X1X2-0.29X1X3-0.32X2X3

對回歸方程進行方差分析，結果見表3。α-淀粉酶活與實驗3個因素的回歸方程的F值為144.09，P<0.01，方程顯著。回歸方程的線性相關系數(shù)為0.989 2，說明因變量與3個自變量之間的線性關系顯著。從表3中可以看出，方程的一次項、二次項、交互項的影響都是顯著的，因此各項試驗因素與α-淀粉酶活力之間的關系不是簡單的線性關系，各因素之間存在一定的交互作用，失擬項P>0.05表明該方程可以接受?？梢岳迷摶貧w方程確定最佳發(fā)芽條件。

表3 回歸方程的方差分析

Tab.3 Significance analysis of model for quadratic response surface model

方差來源自由度平方和均方和F值顯著性回歸91 079.14119.91144.09P<0.01一次項3183.3761.1373.45P<0.01二次項3826.72275.57331.15P<0.01交互項369.0423.0227.66P<0.01殘差誤差54.160.83失擬33.821.287.58P>0.05誤差20.340.17總離差141 083.3

圖4～6直觀地反映了各因素交互作用對響應值的影響。通過比較三組圖可知，發(fā)芽溫度對α-淀粉酶活影響最為顯著，表現(xiàn)為曲線較陡，從單因素試驗可以發(fā)現(xiàn)，發(fā)芽時間對α-淀粉酶活的影響也很顯著，但從生產(chǎn)實際考慮，發(fā)芽時間不能控制太短和太長，在發(fā)芽時間80～120 h對酶活的影響較溫度次之，浸麥度對酶活的影響小，相應表現(xiàn)為曲線較為平緩。

圖4 發(fā)芽溫度與發(fā)芽時間對α-淀粉酶活的交互影響

Fig.4 Effect ofα-amylase activity versus germinating temperature and germinating time

圖5 發(fā)芽溫度與浸麥度對α-淀粉酶活的交互影響

Fig.5 Effect ofα-amylase activity versus germinating temperature and water content

圖6 發(fā)芽時間與浸麥度對α-淀粉酶活的交互影響

Fig.6 Effect ofα-amylase activity versus germinating time and water content

2.3 驗證性試驗

對回歸方程分別以X1、X2和X3對Y求一階偏導數(shù)并令其為零，可得到如下3個方程

3.54-28.12X1-4.13X2-0.29X3=0

(1)

3.06-4.13X1-12.00X2-0.32X3=0

(2)

1.01-0.29X1-0.32X2-5.64X3=0

(3)

聯(lián)立方程組(1)、(2)、(3)，解得X1=0.19、X2=0.18和X3=0.16，即以α-淀粉酶活為響應值，即大麥最佳發(fā)芽條件為發(fā)芽溫度16.8 ℃、發(fā)芽時間為103.6 h和浸麥度為46.5%，由回歸方程可以確定α-淀粉酶最大酶活為56.57 U/g。為檢驗結果的可靠性，采取響應面分析法求得的最佳條件進行試驗，結果得出α-淀粉酶的酶活為56.12 U/g，與理論預測值基本吻合，誤差為0.8%，比單因素試驗最高酶活提高3.8%。因此，利用響應面分析法得到的大麥最佳發(fā)芽條件真實可靠，具有實際意義。

3 結 論

利用響應面分析方法，優(yōu)化了甘啤4號大麥萌發(fā)的條件，結果表明，在獲得較高α-淀粉酶活力(56.12 U/g)的前提下，大麥適宜發(fā)芽條件為發(fā)芽溫度16.8 ℃，發(fā)芽時間103.6 h，浸麥度為46.5%，且發(fā)芽溫度對其影響較明顯。

[1] 李勤. 谷物萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較[J]. 食品與生物, 2007, 102(5):9-10.

[2] 黃祥斌. 制麥過程中的酶變化[J]. 大麥科學, 2003(3):43-44.

[3] 郝學才,余曉斌, 劉志鈺, 等. 響應面方法在優(yōu)化微生物培養(yǎng)基中的應用[J]. 食品研究與開發(fā), 2006, 27(1):38-41.

[4] 管敦儀. 啤酒工業(yè)手冊:中冊[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1982:86-88.

[5] 劉志國,于建生. 生物化學實驗[M] . 武漢:華中科技大學出版社, 2007:123-125.

[6] SKADSEN R W. Physiological and molecular genetic mechanisms regulating hydrolytic enzyme gene expression in cereal grains[J]. Physiologia Plantarum, 2002, 104(3):486-502.

[7] SKADSEN R W. Transcriptome profile of barley aleurone differs between total and polysomal RNAs:implications for proteome modeling[J]. Molecular Breeding, 2008, 21(2):261-269.