孫 筱 筠，張 宗 申

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

東北紅豆杉(TaxuscuspidateSieb.etZucc)又名紫杉[1]，是紅豆杉科紅豆杉屬常綠針葉喬木[2]。矮紫杉(Taxuscuspidate“Nana”)是東北紅豆杉的一種變種。近年來，人們從東北紅豆杉根、莖、葉中分離出抗癌活性成分——紫杉醇[3-5]。世界許多國(guó)家的醫(yī)學(xué)專家研究表明，紫杉醇對(duì)食道癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌及急性白血病有特殊的防治效果，特別是對(duì)晚期卵巢癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌治愈率達(dá)33%，總有效率在75%以上。但是紅豆杉屬植物在自然條件下種子成熟后有長(zhǎng)達(dá)2年的休眠期，種子萌發(fā)率低；再加上屬于雌雄異株，自然結(jié)種率低，種質(zhì)資源少[6-7]，并且樹木分布星散，生長(zhǎng)緩慢，因此東北紅豆杉的繁殖途徑亟待改善。盡管目前有一些關(guān)于東北紅豆杉組織培養(yǎng)的研究報(bào)告[8-9]，但國(guó)內(nèi)尚未有利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑來實(shí)現(xiàn)東北紅豆杉的快速繁殖。本文建立了矮紫杉體細(xì)胞胚發(fā)生和培養(yǎng)體系，以期為制備人工種子以大量生產(chǎn)矮紫杉植株提供理論依據(jù)，達(dá)到保護(hù)珍稀物種和為園林綠化提供優(yōu)質(zhì)種子的目的。

1 材料與方法

1.1 材 料

東北矮紫杉種子，采自大連工業(yè)大學(xué)校園內(nèi)。

1.2 方 法

剝?nèi)シN子的假種皮并在自來水下沖洗干凈，于200 mg/L赤霉素溶液中浸泡24 h之后剝離外種皮。在超凈工作臺(tái)中將種子于75%酒精中處理30 s后用0.1% HgCl2滅菌12 min，無菌去離子水沖洗4～5次，在無菌紙上切開一條長(zhǎng)2 mm的小口后，分別接種到附加3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS、B5、mB5[10]培養(yǎng)基上，于(24±1) ℃黑暗培養(yǎng)。待種子完全裂開后，將露出的種胚轉(zhuǎn)接到相應(yīng)的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)愈傷組織。

將誘導(dǎo)出的愈傷組織分別轉(zhuǎn)移至含有mB5+2 mg/L NAA+0.2 mg/L KT (A)、mB5+3 mg/L ZT (B)和mB5(C)的培養(yǎng)基上，于(24±1) ℃繼續(xù)黑暗培養(yǎng)，研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合對(duì)東北矮紫杉體細(xì)胞胚產(chǎn)生的影響。

以上所有培養(yǎng)基的pH均為5.6，并添加3%蔗糖、0.7%瓊脂。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

將處理好的矮紫杉種子分別接種到MS、B5和mB53種培養(yǎng)基中。這3種培養(yǎng)基中均添加0.5 mg/L 2，4-D、4 mg/L NAA和0.2 mg/L KT。接種60 d后分別統(tǒng)計(jì)矮紫杉愈傷組織的誘導(dǎo)率。

mB5培養(yǎng)基中的種子在接種2 d后開始膨脹；4 d后種子的一端開始裂開(圖1-b)；接種15 d后種子完全裂開并露出種胚(圖1-c)；20 d后種胚開始膨脹(圖1-d)；27 d后種胚開始形成愈傷組織(圖1-e)。B5培養(yǎng)基中的種子在接種7 d后開始膨大，15 d后種子的一端才開始裂開，40 d后種胚開始形成愈傷組織。而MS培養(yǎng)基中的種子在接種20 d后開始膨大，40 d后種子的一端才開始裂開，并且種子褐變嚴(yán)重，60 d后種胚開始形成愈傷組織。

a,東北矮紫杉種子；b,培養(yǎng)4 d后種子裂開；c,培養(yǎng)15 d后種子完全裂開并露出種胚；d,培養(yǎng)20 d后種胚開始膨脹；e,培養(yǎng)27 d后種胚開始形成愈傷組織；f,生長(zhǎng)迅速的愈傷組織；g,白色顆粒狀愈傷組織；h,生長(zhǎng)迅速的白色顆粒狀愈傷組織；i,球狀胚性細(xì)胞團(tuán) (bar=25 μm)

圖1 從種子中誘導(dǎo)體細(xì)胞胚

Fig.1 Initation and development of somatic embryo from the seeds ofTaxuscuspidateSieb.etZucc

由表1可以看出以mB5+0.5 mg/L 2，4-D+4 mg/L NAA+0.2 mg/L KT為培養(yǎng)基的種子愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)66.7%。

表1 不同基本培養(yǎng)基對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Tab.1 The effects of basic medium on the induction of callus from the mature embryo ofTaxuscuspidate

培養(yǎng)基接種數(shù)出愈數(shù)誘導(dǎo)率/%MS47817.0B5432353.5mB5453066.7

2.2 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響2.2.1 生長(zhǎng)素類植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的影響

根據(jù)“2.1”的結(jié)果，選用mB5作為實(shí)驗(yàn)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑效果的基本培養(yǎng)基。在其中添加不同質(zhì)量濃度的2.4-D和NAA以及它們的組合，培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)其愈傷組織誘導(dǎo)率，結(jié)果如表2、3所示。

表2 單因素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Tab.2 The effects of single plant growth regulator on the induction of callus from the mature embryo ofTaxuscuspidate

ρ/(mg·L-1)接種數(shù)出愈數(shù)誘導(dǎo)率/%0.142716.70.5471327.72,4-D1.039512.81.543511.62.04648.71.0431125.62.0472144.7NAA3.0381744.74.0482858.35.0421638.1

由表2可以看出，在培養(yǎng)基中添加NAA比較適合誘導(dǎo)愈傷組織，隨著NAA質(zhì)量濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率也明顯提高。當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)到4 mg/L時(shí)，愈傷組織的誘導(dǎo)率達(dá)到最高，為58.3%；但是當(dāng)質(zhì)量濃度升高到5 mg/L時(shí)誘導(dǎo)率明顯下降，并且種子褐變嚴(yán)重。而單獨(dú)添加2，4-D對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)率影響不明顯。步營(yíng)等[13]在研究盆栽膜莢黃芪愈傷組織生長(zhǎng)中也發(fā)現(xiàn)NAA在誘導(dǎo)愈傷組織的過程中起著決定性的作用，但單獨(dú)添加2，4-D對(duì)其愈傷組織生長(zhǎng)的影響并不顯著，本文結(jié)果與之一致。

表3 雙因素植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Tab.3 The effects of double factors on the induction of callus from the mature embryo ofTaxuscuspidate

ρ/(mg·L-1)2,4-DNAA接種數(shù)出愈數(shù)誘導(dǎo)率/%0.12.0461226.10.13.0431330.20.14.0482552.10.52.0441840.90.53.0472246.80.54.0412663.41.02.0421638.11.03.0401845.01.04.0462554.3

由表3可以看出，同時(shí)添加2，4-D和NAA更有助于愈傷組織的誘導(dǎo)，其中mB5+0.5 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L NAA的誘導(dǎo)率最高為63.4%。

2.2.2 KT對(duì)誘導(dǎo)率的影響

在mB5+0.5 mg/L 2，4-D+4.0 mg/L NAA的培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的KT，研究其對(duì)矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果如表4所示。

表4 KT對(duì)東北矮紫杉種胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

Tab.4 The effect of KT on the induction of callus from the mature embryo ofTaxuscuspidate

ρ(KT)/(mg·L-1)接種數(shù)出愈數(shù)誘導(dǎo)率/%0412663.40.2453066.70.5481633.31.043716.3

結(jié)果表明，KT的質(zhì)量濃度對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)率有一定的影響。其中添加0.2 mg/L KT對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)更為有利，但隨著KT質(zhì)量濃度的增加誘導(dǎo)率下降，并且愈傷組織褐變嚴(yán)重。

2.3 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)東北矮紫杉體細(xì)胞胚發(fā)生的影響將從種胚中誘導(dǎo)的愈傷組織分別轉(zhuǎn)入到培養(yǎng)基A、B、C上繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)20 d后，在培養(yǎng)基B上的愈傷組織表面上出現(xiàn)白色的顆粒狀培養(yǎng)物(圖1-g)，且生長(zhǎng)迅速(圖1-h)；而培養(yǎng)基A上的愈傷組織在40 d后才呈現(xiàn)這種狀態(tài)，并且生長(zhǎng)緩慢；培養(yǎng)基C中的愈傷組織始終無此現(xiàn)象發(fā)生。經(jīng)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基A和B上的愈傷組織均為胚性組織，可以觀察到球狀細(xì)胞團(tuán)(圖1-i)。

雖然2，4-D作為細(xì)胞分裂素對(duì)于胚性組織的誘導(dǎo)是不可缺少的，但是大量研究表明在胚性組織的增殖階段，應(yīng)該及時(shí)的去掉或降低2，4-D濃度，既有利于胚性組織的增殖，也有利于后期的胚胎發(fā)生。因此在培養(yǎng)基A中去掉了2，4-D。崔凱榮等[14]對(duì)枸杞體細(xì)胞胚發(fā)育的研究表明，胚性愈傷組織形成后，如不及時(shí)轉(zhuǎn)入去除2，4-D的培養(yǎng)基中，則胚性細(xì)胞就不能進(jìn)入體細(xì)胞胚胎發(fā)育。

3 結(jié) 論

mB5(pH 5.6，添加3%蔗糖、0.7%瓊脂)培養(yǎng)基較適合誘導(dǎo)東北矮紫杉種子的愈傷組織；而NAA對(duì)于東北矮紫杉種子誘導(dǎo)愈傷組織過程中起著決定性的作用，隨著NAA濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率也明顯提高；在黑暗條件下，mB5+0.5 mg/L 2，4-D+4 mg/L NAA+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基上成功誘導(dǎo)出大量的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)66.7%。

在誘導(dǎo)東北矮紫杉體細(xì)胞胚的過程中發(fā)現(xiàn)，在mB5培養(yǎng)基上添加3 mg/L ZT適合誘導(dǎo)體細(xì)胞胚的發(fā)生。這可能是由于玉米素(Zeatin)是原始天然細(xì)胞分裂素，能夠促進(jìn)細(xì)胞的分裂和擴(kuò)大、促進(jìn)生長(zhǎng)、解除某些需光種子的休眠。但在本實(shí)驗(yàn)中所誘導(dǎo)出的體細(xì)胞胚多處于球形期，是胚狀體的發(fā)育早期階段，并沒有培養(yǎng)出發(fā)育成熟的體細(xì)胞胚，今后對(duì)于如何進(jìn)一步促進(jìn)東北矮紫杉體細(xì)胞胚的成熟有待于繼續(xù)探索。本結(jié)果為以體細(xì)胞胚為繁殖體制備人工種子、從而快速生產(chǎn)出優(yōu)質(zhì)的矮紫杉植株提供了重要依據(jù)。

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