張 佳 娣，邊 蕾，石 屹 峰

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

最近利用人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)為載體延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物體內(nèi)半衰期的技術(shù)已引起了人們的極大關(guān)注。HSA是人血漿中最豐富的蛋白質(zhì)(占血漿總蛋白的60%左右)，分子質(zhì)量為66～69 ku，半衰期可達(dá)到19 d。HSA的生理功能包括維持血漿的膠體滲透壓和正常pH值，是血液中重要的物質(zhì)輸送載體和藥物輸送載體，所以它成為藥物設(shè)計(jì)理想的載體蛋白，用于改善藥物的半衰期[1]，同藥物的連接有融合和黏附兩種方式。HSA黏附方法延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物半衰期的關(guān)鍵是選擇有特異性和親和力高的HSA黏附肽[2]。篩選HSA黏附肽使用噬菌體展示表面技術(shù)，此技術(shù)最大的特點(diǎn)就是能對(duì)較大容量的文庫(kù)進(jìn)行快速篩選。自從Smith[3]于1985年首次報(bào)道運(yùn)用噬菌體展示至今，噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)作為一種技術(shù)平臺(tái)已日趨成熟，并在許多領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用[4]。本文以HSA為靶分子，利用甘氨酸-鹽酸(pH 2.2)為洗脫液對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)進(jìn)行生物淘選，研究同時(shí)以回收率和選擇比為優(yōu)化參數(shù)的定量淘選過(guò)程，并發(fā)展了一種基于噬菌體滴度測(cè)定的相對(duì)親和力測(cè)定方法，測(cè)定其DNA序列后推導(dǎo)出其肽序列。

1 材料與方法

1.1 噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)和菌株

噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)(Ph.D.-7)和E.coliER2738 宿主菌，購(gòu)自New England Biolabs公司。Ph.D.-7的復(fù)雜度為2.8×109個(gè)轉(zhuǎn)化子。E.coliER2738宿主菌：F′lacIqΔ(lacZ)M15proA+B+zzf：Tn 10 (TetR)/fhuA2supEthiΔ(lac-proAB)Δ(hsdMS-mcrB)5 (rk-m k-McrBC-)。

1.2 試劑和儀器

人血清白蛋白(Sigma A1653)、IPTG(Isopropyl β-D-thiogalactoside)和X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside)，北京賽百盛生物工程公司；甘氨酸，天津市福晨化學(xué)試劑廠；Tris(HydroxymethylAminomethane)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。所用培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基(胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 5 g，溶于1 L去離子水，pH 7)。STS-2型脫色搖床，上海琪特儀器有限公司；96微孔板(聚丙烯)，海門三和新華玻璃儀器廠。

1.3 測(cè)定噬菌體滴度

接種E.coliER2738 單菌落于20 mL LB培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期(OD600=0.5)。37 ℃預(yù)溫LB/IPTG/X-gal平板，每個(gè)噬菌體稀釋度取一個(gè)平板備用。用TBS (50 mmol/L pH 7.5 Tris buffered saline solution)對(duì)噬菌體進(jìn)行10倍系列稀釋。每個(gè)稀釋度取10 μL加入到分裝有200 μL的菌體中，快速震蕩混勻，37 ℃溫育1 h后取50 μL涂于LB/IPTG/X-gal 平板上，待平板冷卻5 min后，倒置于37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜。檢查平板，以約有100個(gè)噬菌斑左右的平板上的斑數(shù)計(jì)數(shù)，用此數(shù)目乘以稀釋因子即得到單位體積噬菌體的空斑形成單位(pfu)滴度。

1.4 噬菌體肽庫(kù)的生物淘選

用300 μL 100 μg/mL HSA和300 μL 0.1 mol/L NaHCO3(pH 8.6)分別包被于96酶聯(lián)孔板，4 ℃過(guò)夜，次日取出用0.1% TBST(Tris buffered saline with Tween-20)清洗3次。在孔中加入用TBST稀釋到滴度為2×1011的噬菌體，室溫下放在STS-2型脫色搖床上搖動(dòng)1 h。用TBST清洗10次，洗去未與HSA結(jié)合的噬菌體，再加100 μL Gly-HCl，室溫?fù)u動(dòng)15 min；將洗脫液吸出立即加入15 μL pH 9.1的Tris-HCl緩沖液。洗脫液測(cè)滴度，擴(kuò)增后再測(cè)滴度，用于下一輪篩選。

將擴(kuò)增的噬菌體溶液除去菌體后用 PEG/NaCl 沉淀法純化。先將擴(kuò)增的培養(yǎng)物移至50 mL離心管，10 000 r/min、4 ℃離心10 min；上清液轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃沉淀最少2 h，然后10 000 r/min、4 ℃離心20 min，去上清完成粗提。沉淀物溶解于4 mL TBS中；加入1/5體積的PEG/NaCl溶液，4 ℃沉淀最少1 h，再以10 000 r/min、4 ℃離心20 min，去掉上清液完成精提。沉淀物重新溶解于200 μL TBS得到洗脫噬菌體用于下一輪淘選或鑒定。

1.5 回收率及選擇比

回收率是洗脫得到的噬菌體量與投入的噬菌體量的比值，選擇比是HSA包被板與對(duì)照空白平板上洗脫噬菌體量的比值。

1.6 特異性黏附肽的鑒定

將制備好的單克隆抗體進(jìn)行擴(kuò)增，然后進(jìn)行選擇比測(cè)定。具體操作步驟同噬菌體肽庫(kù)的淘選實(shí)驗(yàn)。將HSA洗脫液和空白洗脫液分別測(cè)滴度，計(jì)算選擇比，選擇比越大說(shuō)明篩選得到的噬菌體特異性越強(qiáng)。

1.7 利用親和力常數(shù)檢測(cè)特異性黏附肽

將離心后的噬菌體富集液稀釋成不同濃度，如原液、2倍、5倍、8倍、10倍稀釋度，作為投入噬菌體量(滴度)。經(jīng)過(guò)淘選過(guò)程，得到洗脫噬菌體量(滴度)。以噬菌體投入量和噬菌體洗脫量為參數(shù)進(jìn)行雙倒數(shù)作圖，計(jì)算得到Kd。

1.8 特異性黏附肽序列的測(cè)定

取擴(kuò)增好的噬菌體20 μL，加入200 μL碘化鈉緩沖液、100 μL氯仿和100 μL苯酚，12 000 r/min離心10 min。除上層苯酚/氯仿后，加入500 μL冰乙醇，室溫溫育10 min，12 000 r/min離心10 min，棄上清。用200 μL 70%的乙醇將沉淀均勻沖開(kāi)，室溫倒置30 min。用1.1 mL TE溶液將沉淀懸起，即可作為噬菌體測(cè)序模板。以-96gIII測(cè)序引物5′-HOCCC TCA TAG TTA GCG TAA CG-3′進(jìn)行樣品DNA測(cè)序(中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司)。

2 結(jié) 果

2.1 噬菌體肽庫(kù)的淘選

為篩選HSA黏附肽，利用噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)共進(jìn)行了4輪“吸附-洗脫-擴(kuò)增”的淘選，測(cè)定了噬菌體的投入量與洗脫量，并計(jì)算了回收率與選擇比，結(jié)果如表1所示。經(jīng)過(guò)4輪淘選后，回收率得到了提高，表示與HSA黏附的噬菌體得到了一定程度的富集。選擇比從第2輪的3.6上升到第4輪的7.1，表示在第4輪洗脫下來(lái)的與人血清白蛋白黏附的噬菌體有明顯的特異性。

表1 噬菌體展示肽庫(kù)淘選人血清黏附肽的回收率和選擇比

Tab.1 The recovery yield and specificity ratio of human albumin binding peptide panning by phage display

輪次投入量/(pfu·mL-1)洗脫量/(pfu·mL-1)回收率選擇比14.40×10118.68×1051.97× 10-824.16×10114.20× 1061.00× 10-73.631.28×10111.76×1071.375× 10-67.042.20×10113.28×1071.49 × 10-67.1

2.2 親和力公式的推導(dǎo)

根據(jù)質(zhì)量作用定律，藥物與受體的相互作用，可用公式(1)表達(dá)：

(1)

式中，D代表藥物，R代表受體，DR代表藥物-受體復(fù)合物。而在本實(shí)驗(yàn)中噬菌體φ代表D，HSA代表R，HSA·φ代表藥物受體復(fù)合物。噬菌體φ與HSA相互作用，如式(2)：

(2)

當(dāng)反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)，解離常數(shù)Kd，可用式(3)表示：

Kd=c(φ)c(HSA)/c(HSA·φ)

(3)

式中，c(φ)、c(HSA)和c(HSA·φ)為相應(yīng)物質(zhì)濃度，解離常數(shù)Kd代表親和力。親和力所測(cè)定的是單獨(dú)的小肽與HSA的黏附能力，而本文所測(cè)定的是連接在噬菌體上的七肽與HSA的黏附能力，故所測(cè)定的親和力稱為相對(duì)親和力。

設(shè)HSA總濃度為游離和結(jié)合噬菌體的濃度之和c(HSA)T=c(HSA)+c(HSA·φ)，代入式(3)則

(4)

經(jīng)推導(dǎo)得

(5)

實(shí)驗(yàn)中與HSA結(jié)合的噬菌體量約等于洗脫的噬菌體量，即

c(HSA·φ) ≈c(φ)e

(6)

實(shí)驗(yàn)條件下投入噬菌體量遠(yuǎn)高于洗脫噬菌體量，即

c(φ)=c(φ)T-c(φ)e≈c(φ)T

(7)

經(jīng)推導(dǎo)得

(8)

2.3 特異性黏附肽親和力常數(shù)的測(cè)定

從制備好的單克隆抗體中進(jìn)行特異性黏附肽的篩選，得到4個(gè)特異性強(qiáng)的HSA黏附肽，分別編號(hào)為HSA-1、HSA-5、HSA-6、HSA-10，對(duì)它們進(jìn)行親和力常數(shù)的測(cè)定。以HSA-1為例進(jìn)行說(shuō)明：將HSA-1噬菌體進(jìn)行大量富集，將離心得到的富集液進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，利用測(cè)滴度方法分別得到噬菌體投入量。同淘選過(guò)程一樣，將噬菌體同HSA孵育，先清洗除去未結(jié)合的噬菌體，再Gly-HCl酸性洗脫掉與HSA結(jié)合的噬菌體，利用測(cè)滴度的辦法得到不同濃度噬菌體的洗脫量。用Origin7.5軟件進(jìn)行線性擬合得到相對(duì)親和力。如圖1所示，隨著噬菌體投入量的不斷升高其洗脫量也在不斷升高，直線與X軸的交點(diǎn)即為-1/Kd。因此由線性關(guān)系可得到Kd值為7.335 μmol/L，HSA-5、HSA-6、HSA-10人血清白蛋白黏附肽的相對(duì)親和力結(jié)果見(jiàn)表2。

圖1 雙倒數(shù)法對(duì)人血清白蛋白黏附肽相對(duì)親和力常數(shù)的測(cè)定

Fig.1 Double reciprocal plot for relative affinity constant measurement of human serum albumin binding peptide [c(φ)eis the output phage，c(φ)Tis the total input phage.]

表2 人血清白蛋白黏附肽相對(duì)親和力和序列

Tab.2 Relative affinity constant and peptide sequence of human serum albumin binding peptide

噬菌體HSA黏附肽選擇比相對(duì)親和力/(μmol·L-1)肽序列HSA-15.60.73IKLLTLRHSA-5 7.00.42TQRKRRKHSA-64.50.81RRMSTRIHSA-1026.00.15HMSTRMR

2.4 特異性黏附肽序列的測(cè)定

對(duì)特異性比較強(qiáng)的HSA-1、HSA-5、HSA-6、HSA-10 HSA黏附肽進(jìn)行序列的測(cè)定：分別提取DNA，以-96引物進(jìn)行樣品DNA測(cè)序，得到4個(gè)陽(yáng)性克隆所展示的七肽序列，結(jié)果如表2所示。所挑選出的特異性較強(qiáng)的4個(gè)特異性黏附肽，經(jīng)測(cè)定其相對(duì)親和力達(dá)到微摩爾水平，說(shuō)明它們與HSA具有很強(qiáng)的結(jié)合能力。測(cè)定的4個(gè)序列和親和力不同，說(shuō)明了篩選出的4個(gè)特異性HSAB(HSA-Binding)黏附肽可能黏附HSA不同部位。

3 討 論

本研究利用噬菌體表面展示技術(shù)對(duì)隨機(jī)七肽庫(kù)進(jìn)行生物淘洗，以回收率和選擇比為淘選和特異性鑒定的定量標(biāo)準(zhǔn)，以判斷淘選的效率和噬菌體特異性結(jié)合的能力。回收率提高說(shuō)明對(duì)靶分子黏附能力較大的肽得到富集，選擇比大于1而且逐輪提高說(shuō)明黏附靶分子而不是空白對(duì)照孔板上黏附的肽得到富集，因此選擇比也是一個(gè)保證淘選成功(不可或缺)的操作參數(shù)。本文將回收率和選擇比同時(shí)作為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，經(jīng)過(guò)對(duì)噬菌體隨機(jī)七肽庫(kù)的4輪生物淘選，回收率第4輪比第1輪提高了75.6倍，選擇比也從第2輪的3.6上升到第4輪的7.1，更加有力地證明了HSA特異性黏附肽良好的富集狀況。

另外，本研究以噬菌體滴度測(cè)定的方法鑒定HSA黏附肽的相對(duì)親和力[5]，由于噬菌體融合HSA黏附肽，此方法測(cè)定的親和力是HSA黏附肽相對(duì)親和力，但仍然是噬菌體展示肽有效的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，而且簡(jiǎn)單易操作，不使用抗體(ELISA)和更多儀器。該法得到HSA黏附肽相對(duì)親和力為0.73 μmol/L。Dennis等[6]利用表面離子共振技術(shù)測(cè)定SA21十二肽段與HSA的親和力為0.467 μmol/L，(SA21具有延長(zhǎng)半衰期的功效，可在兔子的靜脈中長(zhǎng)達(dá)2.3 h，) 親和力常數(shù)在同一數(shù)量級(jí)，且較為相近。

比較非共價(jià)(黏附)與共價(jià)形式與HSA進(jìn)行連接，兩者都是HSA為載體的有效延長(zhǎng)蛋白質(zhì)藥物半衰期的手段，但是HSA融合蛋白質(zhì)生物活性因融合近70 ku的HSA而損失較大，Albuferon-α生物活性降低8倍盡管半衰期延長(zhǎng)18倍[3-4]；而與HSA 黏附肽(小肽)融合可以保持與靶蛋白的結(jié)合特性，并延長(zhǎng)藥物半衰期，AB.Fab半衰期延長(zhǎng)6倍且保持原生物活性，AlbudAb/IL-1ra的半衰期延長(zhǎng)129倍[7]。由于HSA在血清中較高的濃度，即使親和力較低的HSA黏附肽融合蛋白也將會(huì)有機(jī)會(huì)結(jié)合HSA，特別是重組藥物蛋白分子質(zhì)量變化不大，可保持生物活性和組織滲透能力。黏附HSA已經(jīng)成為蛋白質(zhì)藥物長(zhǎng)效化的一種新策略。

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