孫 佳 佳，王 紅 英，錢 斯 日 古 楞，常 凱

( 大連工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院， 遼寧 大連 116034 )

0 引 言

膠原蛋白酶 (Collagenase，E.C 3.4.24.3)是作用于膠原或其變性明膠而不作用其他蛋白質(zhì)的酶類。它來源廣泛，多種微生物以及動物的許多組織細胞都可以產(chǎn)生膠原蛋白酶[1]。目前已發(fā)現(xiàn)溶組織梭菌、溶藻弧菌等微生物能產(chǎn)生膠原蛋白酶，并不斷發(fā)現(xiàn)新的產(chǎn)膠原蛋白酶的微生物[2]。

枯草芽孢桿菌生境多樣，可利用的營養(yǎng)物質(zhì)種類十分豐富，這決定了其具有豐富的產(chǎn)酶系統(tǒng)，具備生產(chǎn)多種酶的應(yīng)用潛力[3]。研究表明，枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)生蛋白酶、淀粉酶、纖維素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果膠酶和木聚糖酶等十幾種酶[4]。近年來，對枯草芽孢桿菌的研究已漸進到遺傳學(xué)與微生物學(xué)領(lǐng)域[5]，但由枯草芽孢桿菌提取出膠原蛋白酶的文章還未見報道。本實驗以海產(chǎn)品市場附近的污泥為樣品，篩選新的高產(chǎn)膠原蛋白酶的微生物，并對其進行初步鑒定。

1 材料與方法

1.1 材 料

樣品，采自大連市海產(chǎn)品批發(fā)市場附近的污泥。

主要試劑：膠原蛋白粉末，本實驗室自制；酪蛋白，金鉑銥科技有限公司。

1.2 產(chǎn)膠原蛋白酶菌的篩選

1.2.1 培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基(100 mL)：膠原蛋白 10 g，酵母膏 0.01 g。

明膠培養(yǎng)基(100 mL)：明膠 2.0 g，蛋白胨 0.5 g，KH2PO40.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，NaCl 0.01 g，pH 7.2～7.5，瓊脂1.5 g。

1.2.2 富集培養(yǎng)

取污泥10 g置于三角瓶中，加100 mL富集培養(yǎng)基。在32 ℃搖床培養(yǎng)48 h后過濾，取濾液。

1.2.3 初 篩

將濾液稀釋，分別在10-1～10-8下各取1 mL于明膠培養(yǎng)基用稀釋涂布法在平皿上將菌液涂勻，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h，選擇生長良好、形態(tài)明顯并有透明圈菌落的平皿。

1.2.4 復(fù) 篩

將培養(yǎng)較好的平皿中的菌落點種到明膠培養(yǎng)基上，28 ℃條件下培養(yǎng)48 h后，挑選出培養(yǎng)基上產(chǎn)生透明圈明顯的單菌落。將此單菌落在明膠培養(yǎng)基上重復(fù)培養(yǎng)5次，菌落生長狀態(tài)穩(wěn)定，由此證明它的菌株傳代穩(wěn)定性好。

1.2.5 菌種的確定

菌落形態(tài)觀察參考《伯杰氏鑒定手冊》及相關(guān)生物實驗教程。各項生理生化指標(biāo)采用細菌鑒定常規(guī)方法。

通過對初步篩選出的菌種進行甲基紅(MR)、革蘭氏染色、明膠液化實驗等菌種的生理生化實驗，來確定能夠產(chǎn)膠原蛋白酶的菌種。

1.3 膠原蛋白酶的提取及酶活的測定

1.3.1 提 取

將通過生理生化實驗篩選出的菌種，在明膠液體培養(yǎng)基上，32 ℃條件下培養(yǎng)48 h。然后將培養(yǎng)液4 000 r/min離心10 min，取上清液。冰浴條件下，在上清液中緩慢加入硫酸銨至終質(zhì)量分數(shù)為70%。4 ℃靜置過夜后，8 000 r/min離心15 min，收集沉淀，沉淀溶解到pH 7.5緩沖溶液中，透析24 h后冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶活測定

取1支試管，加入2.0 mL 0.5%的酪蛋白溶液，于30 ℃水浴中預(yù)熱5 min，再加入1.0 mL已預(yù)熱好的枯草桿菌蛋白酶液，水浴中準(zhǔn)確保溫10 min后，立即加入3.0 mL的10%三氯醋酸溶液，搖勻靜置15 min，過濾，收集的即是樣品的濾液。另取一試管，先加入1.0 mL酶液和3.0 mL的10%三氯醋酸溶液，再加入2.0 mL 0.5%的酪蛋白溶液，混勻后于30 ℃水浴保溫10 min，過濾，收集濾液作為對照溶液。

另取3支試管，分別加入1 mL樣品濾液、對照濾液和水，然后各加入5 mL 0.55 mol/L 碳酸鈉溶液和1 mL Folin-酚試劑，搖勻后在30 ℃下顯色15 min，在680 nm處測吸光值。以酪氨酸為標(biāo)準(zhǔn)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

酶活力(U)=(A樣-A對)×K×N×V/t

式中，A樣為樣品液吸光度值；A對為對照液吸光度值；K為吸光度值1對應(yīng)的酪氨酸微克數(shù)；t為酶促反應(yīng)時間；N為酶液稀釋倍數(shù)(本實驗N為1)；V為酶促反應(yīng)總體積。

酶活力單位定義：在30 ℃、pH為7.5的條件下，1 mL酶液每分鐘水解膠原蛋白產(chǎn)生相當(dāng)于1 μmol酪氨酸的酶量為1個酶活力單位(U)，即1 mL枯草桿菌蛋白酶液所具有的活性。

1.4 膠原蛋白酶法轉(zhuǎn)化及產(chǎn)物

將膠原蛋白溶液與酶液，按體積比1∶0.5、1∶1和1∶2各配置3份，在37 ℃條件下分別反應(yīng)4、8和24 h。采用SDS-PAGE凝膠電泳測定膠原蛋白酶水解情況及產(chǎn)物分子質(zhì)量分布范圍。

2 結(jié)果與討論

2.1 膠原蛋白酶產(chǎn)生菌的篩選

2.1.1 分離純化

通過初步篩選在10-5梯度下獲得3個菌種，利用劃線分離法分別對其進行分離純化以獲得單個菌種，結(jié)果如圖1所示。

圖1 菌種圖片

2.1.2 菌種的確定

為了確定篩選的3個菌種是否為最后所需菌種，對其進行生理生化鑒定，結(jié)果如表1所示。由表1可以看出，②號菌的明膠液化實驗為陽性，說明它所產(chǎn)生的酶能夠使明膠液化，即能夠水解明膠，所以確定它為所需菌種。

將②號菌種通過顯微鏡觀察，其細胞呈直桿狀，大小(0.8～1.2) μm×(1.5～4.0) μm，單個，革蘭氏染色陽性，著色均勻，產(chǎn)莢膜，周生鞭毛；芽孢中生或近中生，小于或等于細胞寬。

通過進一步的生理生化實驗發(fā)現(xiàn)，②號具有以下特性：專性好氧，不具凝乳作用，過氧化氫酶實驗、硝酸鹽還原實驗、V-P實驗陽性；苯丙氨酸脫氫酶實驗、卵黃卵磷脂酶實驗陰性；分解葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，能分解阿拉伯糖、甘露醇、酪素、明膠淀粉。

利用電鏡觀察，橢圓形，不明顯膨脹，低凸起，表面皺褶。

通過以上實驗可以看出，②號菌種具有典型的芽孢桿菌特征，由此可以確定篩選出的菌種為枯草芽孢桿菌。

表1 篩選菌種的生理生化特性

2.2 酶活力的測定

將②號菌經(jīng)過明膠液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，提取它所產(chǎn)生的膠原蛋白酶并測其酶活。測得A樣=0.296，A對=0.026。計算得，酶活力(U)=44.982 U/mL

由于是粗酶液，含有其他酶類且稀釋度較大，所以酶活力較小。

2.3 膠原蛋白酶轉(zhuǎn)化及其產(chǎn)物

將膠原蛋白溶液與酶液按比例混合，在一定條件下反應(yīng)。采用SDS-PAGE凝膠電泳測定膠原蛋白酶解情況及產(chǎn)物分子質(zhì)量范圍。

1，膠原蛋白；2，底物與酶1∶2體積比混合反應(yīng)8 h后的反應(yīng)液；3，標(biāo)準(zhǔn)Marker，肌球蛋白200 ku；β半乳糖苷酶116 ku；磷酸酶b 97.2 ku；牛血清蛋白66.4 ku;碳酸苷酶29 ku;胰蛋白酶抑制劑20.1 ku;抑肽酶6.5 ku

圖2 SDS-PAGE電泳圖

Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis picture

由電泳結(jié)果可知，篩選出的枯草桿菌能夠產(chǎn)膠原蛋白酶并能水解膠原蛋白。

3 結(jié) 論

實驗結(jié)果表明，以海產(chǎn)品市場附近采集的污泥為樣品，經(jīng)過富集培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后在10-5的稀釋度下利用明膠培養(yǎng)基篩選出能夠產(chǎn)膠原蛋白酶的菌種，并且菌種傳代穩(wěn)定性非常高。通過生理生化實驗和電鏡觀察，確定篩選出的菌種為枯草芽孢桿菌。對其產(chǎn)的膠原蛋白酶進行分離和活力測定，得到的酶活力為44.982 U/mL。電泳結(jié)果證明，篩選出的枯草芽孢桿菌能夠產(chǎn)膠原蛋白酶，在底物與酶1∶2體積比混合反應(yīng)8 h后，能夠使分子質(zhì)量為100 ku左右的膠原蛋白水解成8 ku左右的短肽。

[1] 李文俊,郭曉奎,姜敘誠. 微生物膠原酶[J]. 微生物學(xué)雜志, 2004, 24(2):32-38.

[2] 張娟,劉書亮,吳琦,等. 產(chǎn)彈性蛋白酶芽孢桿菌的篩選與鑒定[J]. 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報, 2007, 25(3):253-261.

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