陳 一

[摘要] 本文旨在研究在將間質(zhì)干細胞(MSC)移植于人類羊膜(HAM)后,注入損傷兔體全皮的條件下兔體全皮損傷的修復效果。4組兔體的全皮有大致相同的五個缺損傷口,它們分別被不同的藥劑處理,其中:A組被融合自體同源MSC的HAM所處理;B組被融合異體同種MSC的HAM所處理;C組被HAM所處理,同時注射自體同源的MSC;D組被HAM所處理,同時注射異體同種的MSC。

在藥劑注入的7、12及15天后,每個兔體小組內(nèi)兔皮傷口的大小均有所測量及記錄。一般情況下,藥劑注入25天后幾個小組兔皮傷口均陸續(xù)愈合。用蘇木精與曙紅對創(chuàng)口染色并在顯微鏡下觀察,染色區(qū)可觀察到表皮與真皮層顆粒狀組織數(shù)量及其他特征。

其中,A、B兩組在藥劑注入術后的7、12、15天后傷口愈合相關數(shù)據(jù)方面進展明顯,在皮膚傷口修復方面表現(xiàn)出最為顯著的效果。且A、B兩組數(shù)據(jù)沒有統(tǒng)計學上顯著的差異。

對A、B兩組進行組織學水平檢查,發(fā)現(xiàn)成熟分化的薄層表皮,以及附著沉積膠原蛋白束的真皮層皮膚組織附件,附件完全恢復;C、D兩組為不成熟分泌薄壁細胞的致密表皮,真皮層皮膚成纖維細胞不斷增殖,附件不完全恢復。因此,填充MSC的HAM的注入對于兔皮組織缺損修復起著重要作用,而自體同源MSC與異體同種MSC的植入對于傷口的愈合情況沒有顯著的效果差異。

[關鍵詞]羊膜組織 間質(zhì)干細胞 組織工程移植皮膚組織缺損修復

簡介

本實驗選用骨髓干細胞與羊膜組織融合體修復缺損的皮膚組織,探討的主要問題是:一、人類羊膜(HAM)與骨髓干細胞(MSC)融合后注入的修復效果與HAM、MSC分別注入的修復效果比較;二、異體同種干細胞與自體同源干細胞在修復過程中的效果比較。

在最近的研究中,異體同種間質(zhì)干細胞(MSC)被證明在促進傷口愈合方面作用顯著,無論是單獨注入皮膚傷口處還是與人類羊膜(HAM)融合后注入傷口處。本研究旨在調(diào)查將MSC與HAM融合后植入兔全皮損傷處對傷口愈合的影響。

一、實驗材料與具體方法

1.取材動物:健康白兔。數(shù)量:21只;年齡:15周左右;體重:2-2.5千克。

2.分配方式:其中一只用于異體同種干細胞的取材;另外20只被隨機平均分配到A、B、C、D四組中。每組白兔均在相同環(huán)境中喂養(yǎng),食物與水的份量均按標準給予。

3.人類羊膜(HAM)的準備:提取胎盤材料,在含抗生素的無菌環(huán)溶液中浸泡清除血漬。將羊膜小心剝離,用無菌環(huán)溶液漂洗,上皮朝上放置于硝化纖維紙上于-80℃環(huán)境中保存。使用前取出,于37℃環(huán)境中放置30分鐘,剝離硝化纖維膜,上皮朝上置于載玻片。將羊膜于37℃0.25%胰島素-乙二胺四乙酸中浸泡30分鐘后用磷酸緩沖鹽溶液沖洗。

4.間質(zhì)干細胞(MSC)的隔離培養(yǎng):自體同源間質(zhì)干細胞通過穿刺實驗組中白兔股骨末端而取得;異體同種間質(zhì)干細胞則取自未被分進組內(nèi)的白兔,無菌條件下取得。提取骨髓2ml,置于含肝磷脂的無菌試管內(nèi)。于萃取液中分層篩選出紅血球,將浮于表層的血漿倒掉。將骨髓樣品倒入1.077g/ml Ficoll-Hypaque溶液中,在室溫下以1000r/min的速度離心20分鐘。隨后可用10%胎兒血清和抗生素(100IU/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素)在底部溶液中央及溶液界面處提取干細胞,并以106個/ml的細胞密度將其轉(zhuǎn)移到組織培養(yǎng)瓶內(nèi)。培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱內(nèi),周圍氣體環(huán)境潮濕(5%CO2,95%空氣,37℃)。48小時后第一次換氣,之后每2-3天換一次。原始培養(yǎng)大約持續(xù)7-10天,在此期間,非粘附性的造血細胞碎片被遺棄。培養(yǎng)細胞分裂一定次數(shù)后注入0.25%胰島素溶液與0.02%乙二胺四乙酸溶液使之傳代2-3次。

5.間質(zhì)干細胞(MSC)在人類羊膜(HAM)表面的轉(zhuǎn)染與填充:轉(zhuǎn)染細胞在使用前于37℃,5%CO2環(huán)境下在全能補給性培養(yǎng)基上放置4小時。隨后用CD45,73,105, 166流式細胞計測間質(zhì)干細胞的顯型與純度。將細胞活素基因(干細胞因子)轉(zhuǎn)染至曾活體傳代的間質(zhì)干細胞中,并對細胞標記上綠色熒光蛋白質(zhì)后融合進羊膜,熒光鏡檢確保轉(zhuǎn)染成功。流式細胞計分析結(jié)果表明傳代間質(zhì)干細胞的純度約為85%-97%。

在羊膜組織表面用播種環(huán)劃下填充間質(zhì)干細胞(MSC)的范圍。轉(zhuǎn)染前3小時抽離MSC介質(zhì)并置換新鮮培養(yǎng)基。使用磷酸鈣對細胞進行轉(zhuǎn)染。在無菌試管內(nèi)加入DNA、氯化鈣以及足量的蒸餾水,另一試管內(nèi)加入額定數(shù)量的緩沖鹽溶液。將無菌試管內(nèi)溶液倒入緩沖液,一邊倒入一邊搖勻,倒畢后于室溫放置30分鐘后繼續(xù)搖勻。最后,將溶液倒至HAM所在的培養(yǎng)皿上,輕輕搖晃使之在HAM表面分布均衡。隨后立即用冷凍纖維蛋白黏合劑將間質(zhì)干細胞(MSC)融合入羊膜組織內(nèi)并在37℃,5%CO2環(huán)境下結(jié)合。48小時后進行熒光鏡檢,確保MSC與HAM充分融合。

6.實驗操作具體過程:20只白兔被隨機均分成4組,在無菌室內(nèi)用消毒手術器械在每只白兔背部劃下位置、面積與深度基本相同的傷口,并在傷口處各取1.5cm×1.5cm的全皮組織。依組別差異,傷口上均勻涂抹相應的HAM試劑并縫合傷口。A組5只白兔的傷口涂上融合自體同源MSC的HAM,B組5只白兔的傷口涂上融合異體同種MSC的HAM,細胞個數(shù)大約為2×105(融合液2ml);C組5只白兔的全皮組織傷口涂上HAM,隨后注入自體同源MSC,D組5只白兔的全皮組織傷口涂上HAM,隨后注入異體同種MSC,MSC溶液0.5ml。為防止羊膜脫落脫水,傷口采用標準濕敷后將白兔放進籠中,避免傷口感染。

7.創(chuàng)口尺寸測量與組織學評估:使白兔呈標準臥姿,對傷口情況進行拍攝并測量傷口尺寸。移植15天后,傷口基本結(jié)痂;在移植手術進行7天、12天及15天后對肉眼可見的傷口尺寸進行測量。傷口大多在移植手術后25天完全愈合。痊愈的損傷區(qū)域上可見一道正常組織的模糊界線(10mm長,10mm寬,5mm深),將損傷分為兩部分。將組織浸入10%福爾馬林液,并牢牢嵌入石蠟中封裝。被蘇木精及曙紅染色的區(qū)域可在顯微鏡下觀測到表皮與真皮層顆粒狀組織的數(shù)量,從而可精確評估傷口愈合質(zhì)量。

二、實驗結(jié)果

1.取材動物:25天后,所有白兔皮膚傷口已經(jīng)完全痊愈,表皮開始再生。

2.創(chuàng)口尺寸測量:A、B兩組在移植手術后7天、12天和15天在傷口愈合方面表現(xiàn)出統(tǒng)計學上明顯的好轉(zhuǎn)特征,因而在修復缺損上效果明顯。第7天,A組與B組傷口愈合程度分別為45.3±7.2%與43.7±2.8%,而C組與D組傷口愈合程度分別為16.2±4.9%與14.3±6.7%。A組在傷口愈合比率上有輕微高于B組的趨勢,但無明顯數(shù)字特征表明兩者在促進傷口愈合能力方面的大小區(qū)別。

3.組織學評估: 25天后,A組材料組織的表皮與真皮層都恢復良好。表皮較薄,細胞分化成熟,真皮可見不斷分裂的成纖維細胞。此外存在較輕炎癥反應,血管分布輕微擴張。D組亦可見中心增稠的表皮,真皮纖維化廣泛分布;毛細血管形成,成纖維細胞加速分裂,存在輕微炎癥反應。C、D兩組皮膚附件亦有部分恢復。

4.實驗結(jié)論:異體同種HAM被用于一系列外科手術中,或治愈疾病,或代替壞死組織,或用于皮膚、眼角膜、眼球結(jié)膜的慢性傷口包扎。雖然羊膜有很多利于組織缺損修復的結(jié)構特點,例如免疫特性、抗菌效果,以及在應用中減緩痛苦的效力等等,但它卻并不一定適宜于臨床應用。羊膜的免疫特性具有位點專一性,它也被廣泛應用于眼科治療,例如眼角膜---另一個具免疫特性的位點。異體同種羊膜組織也有其他方面的應用,但免疫識別和應答的概率依然保持不變。就目前而言,羊膜以及其細胞因其較低的免疫原特性而能成為理想的移植組織。

MSC是具有多重效果的細胞,且可根據(jù)生長轉(zhuǎn)化因子系不同組分的活動分為不同種類的細胞。初步臨床實驗結(jié)果表明,MSC的自身移植術可能改善心肌梗死的心臟功能。干細胞的成形或分化轉(zhuǎn)移過程始終是發(fā)展生物學、細胞生物學以及干細胞生物學等領域研究的核心部分。MSC現(xiàn)則是廣泛應用的用于修復和再生的細胞來源。雖然干細胞有著正面作用的治療潛力,但臨床應用對其而言依然需面臨諸多挑戰(zhàn)。毋庸置疑,細胞移植的小環(huán)境對于MSC皮膚附件的定位與成型起著至關重要的作用。

研究結(jié)果表明,間質(zhì)干細胞(MSC)在與羊膜組織(HAM)融合后注入全皮組織,修復損傷的效果較為明顯;分別注射間質(zhì)干細胞與羊膜組織后的全皮組織傷口愈合情況遠較前者遲緩,但全皮組織在移植干細胞后出現(xiàn)不明干細胞特性。干細胞的作用機理還需要深層次的實驗探究,探究對象包括干細胞末期分化形式以及在非造血組織中的干細胞可塑性。

總而言之,在兔全皮組織損傷修復的過程中,羊膜組織的融合對于骨髓干細胞移植的修復皮膚組織缺損效果有極強的推動作用。其中,自體同源干細胞與異體同種干細胞融合移植效果上無明顯區(qū)別,均具有較強的修復缺損能力和促進再生能力。

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作者簡介:

陳一(1990-),女,重慶市人,在讀學士,主要研究方向:生物材料與組織工程。