陳 超,孟慶國,周建樹,楊澤濤,趙 潔,韓 冰,李 楊,田 浩,王尚杰

(1.遼寧省微生物科學研究院,遼寧朝陽 122000;2.遼寧省葫蘆島市八家子經(jīng)濟開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)站,遼寧葫蘆島 125316)

滑菇原生質(zhì)體制備研究

陳 超1,孟慶國1,周建樹1,楊澤濤1,趙 潔1,韓 冰1,李 楊1,田 浩1,王尚杰2

(1.遼寧省微生物科學研究院,遼寧朝陽 122000;2.遼寧省葫蘆島市八家子經(jīng)濟開發(fā)區(qū)農(nóng)業(yè)站,遼寧葫蘆島 125316)

通過對滑菇原生質(zhì)體最佳制備條件的研究表明:利用OS培養(yǎng)基、1.5%溶壁酶將培養(yǎng)13 d的滑菇菌絲在0.6 mol/L甘露醇、pH 6.5、25℃條件下酶解5 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量最高,可達4.85×106個/mL。

滑菇;原生質(zhì)體;制備

滑菇味道鮮美,營養(yǎng)豐富,表面附著的黏性物質(zhì)是一種核酸,對保持人體的精力和腦力大有益處,同時還有抑制腫瘤的作用。我國1976年從日本引進滑菇栽培技術(shù),目前以遼寧省和河北省栽培面積最大。號稱“全國滑菇第一鎮(zhèn)”的岫巖,全鎮(zhèn)2萬多名農(nóng)民栽培滑菇。由于滑菇原生質(zhì)體沒有細胞壁,對誘變劑較敏感,是良好的誘變和融合對象,對食用菌育種具有重要意義。目前國內(nèi)外有關(guān)食用菌原生質(zhì)體制備和分離研究的報道較多,但關(guān)于滑菇的報道還較少。本文研究不同因素對滑菇原生質(zhì)體分離效果的影響,摸索出滑菇原生質(zhì)體制備的優(yōu)化組合,并首次探討了滑菇的不同生長期及不同部位(子實體、菌絲體和孢子)對滑菇原生質(zhì)體產(chǎn)量的影響,為開展滑菇細胞工程育種和基因工程提供了參考數(shù)據(jù)[1]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 滑菇C3-1,本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯汁200 g,葡萄糖20 g,水1000 mL;②OS培養(yǎng)基:洋蔥提取物80 g,蔗糖50 g,醬油50 mL,水1000 mL;③GYP培養(yǎng)基:葡萄糖20 g,酵母粉1.5 g,蛋白胨1.5 g,水1000 mL;④混合培養(yǎng)基:滑菇子實體提取物200 g,馬鈴薯200 g,葡萄糖20 g,洋蔥提取物80 g,硫酸鎂0.5 g,磷酸二氫鉀2 g,水1000 mL。

1.1.3 試劑 溶壁酶,廣東省微生物研究所。

1.2 原生質(zhì)體制備方法

1.2.1 酶液配制 稱取適量溶壁酶溶于0.6 mol/L穩(wěn)滲劑,0.22μm微孔濾膜過濾除菌后備用。

1.2.2 菌絲培養(yǎng) 取直徑5 mm的菌絲塊接種于盛有100 mL液體培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中,每瓶接種1塊,25℃靜置培養(yǎng)13 d。

1.2.3 原生質(zhì)體制備與計數(shù) 將培養(yǎng)好的菌絲用相應穩(wěn)滲劑洗滌3次,無菌濾紙吸取多余水分,每250 mg濕菌絲加1 mL酶液,在適當溫度水浴酶解一定時間,雙層擦鏡紙過濾,置于離心管中, 1000 r/min離心10 min,棄去上清液,吸取1 mL酶解液,血球計數(shù)板計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)產(chǎn)量影響 脫去細胞壁的原生質(zhì)體很脆弱,需要用特定滲透壓穩(wěn)定劑來保護,可維持原生質(zhì)體內(nèi)外環(huán)境滲透壓的相對穩(wěn)定,避免其吸水漲破,同時也能促進質(zhì)壁分離和調(diào)節(jié)酶活。一般情況,無機鹽及糖醇類都可作滲透穩(wěn)定劑。本實驗選擇氯化鉀、硫酸鎂、蔗糖、甘露醇為滲透壓穩(wěn)定劑,濃度分別為0.3、0.6、0.9 mol/L,在pH 5.5、30℃、1.5%溶壁酶、OS培養(yǎng)基條件下酶解2 h,結(jié)果見表1。經(jīng)極差分析,結(jié)果表明原生質(zhì)制備和分離過程中,有機糖醇類原生質(zhì)產(chǎn)量明顯優(yōu)于無機鹽類,其中0.6 mol/L的甘露醇原生質(zhì)產(chǎn)量4.35×106個/mL,效果最好。

2.1.2 實驗結(jié)果分析 不同酶濃度、培養(yǎng)基、酶解時間、酶解溫度、pH值、培養(yǎng)時間對原生質(zhì)產(chǎn)量的影響,結(jié)果見表2。

表1 滲透壓穩(wěn)定劑對原生質(zhì)產(chǎn)量影響(單位:個/mL)Table 1 The effect of stabilization on protoplast field

表2 不同酶濃度、培養(yǎng)基、酶解時間、酶解溫度、pH值、培養(yǎng)時間對原生質(zhì)產(chǎn)量影響Table 2 The effect of lywallzyme consistence、culture、disintegrate enzyme time、disintegrate enzyme temperature、pH、culture time effect on protoplast field

從表2看出,2.0%酶濃度原生質(zhì)產(chǎn)量最大4.85×106個/mL,超過2.0%菌體脫壁太徹底,降低原生質(zhì)再生能力。1.5%酶濃度和2%酶濃度原生質(zhì)產(chǎn)量差異并不顯著,綜合考慮最佳酶濃度為1.5%;洋蔥含有利于原生質(zhì)體生長的物質(zhì),OS培養(yǎng)基原生質(zhì)產(chǎn)量最高,達4.75× 106個/mL;酶解時間延長,原生質(zhì)產(chǎn)量逐漸增加,5 h最大4.81×106個/mL。超過5 h,酶系統(tǒng)中過氧化物酶對原生質(zhì)體損害強,原生質(zhì)體活性降低,甚至造成原生質(zhì)體破裂,導致產(chǎn)量降低[2];酶解溫度升高,原生質(zhì)體產(chǎn)量逐漸增加, 25℃最高4.75×106個/mL。超過25℃產(chǎn)量下降;酶解液pH值對滑菇原生質(zhì)體分離也有明顯的影響,但表現(xiàn)并不一致。原生質(zhì)體釋放呈低-高-低的趨勢,其中pH值為6.5時的釋放量最高,以下依次為6.0、5.5、5.0(7.0)、4.5、7.5。pH 5.5原生質(zhì)產(chǎn)量最高4.65×106個/mL,小于或大于6.5時下降;菌絲培養(yǎng)13 d原生質(zhì)產(chǎn)量最高4.75×106個/mL,并且多從菌絲側(cè)面釋放,體積較大,易于再生。菌齡不足13 d原生質(zhì)體多從菌絲尖端釋放,體積小、易破裂。

2.2 正交試驗結(jié)果分析

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果,溶壁酶濃度為1.5%,培養(yǎng)基為OS培養(yǎng)基,培養(yǎng)菌齡13 d,選擇原生質(zhì)體制備率高的4個因素和3個水平進行L9(34)試驗(見表3),采用極差分析法對結(jié)果進行分析(見表4)。

表3 滑菇原生質(zhì)體制備因素與水平Table 3 Protoplast preparation factors and levels of Pholiota nameko

從表4可以看出,DB＞DD＞DA＞DC,說明酶解溫度是影響原生質(zhì)體制備率的最主要因素,其次是酶解時間及滲透壓穩(wěn)定劑的種類,pH對滑菇原生質(zhì)體制備率影響最不明顯。從試驗結(jié)果中可以看出,B2D2C2A1是滑菇原生質(zhì)體制備條件的最優(yōu)組合。就酶解溫度來說,由于K2＞K3＞K1,說明隨著酶解溫度的增長,原生質(zhì)體制備率隨之升高,25℃原生質(zhì)體制備率已近高峰,若溫度繼續(xù)增長,原生質(zhì)體制備率會有下降的趨勢,這也與單因素試驗的結(jié)果相符合。從酶解時間看,由于K2＞K3＞K1,這說明酶解5 h是原生質(zhì)體制備率的高峰期,5 h時原生質(zhì)體制備率開始出現(xiàn)下降的趨勢,這也與單因素試驗的結(jié)果相符。從滲透壓穩(wěn)定劑種類看,K1＞K3＞K2,說明滲透壓穩(wěn)定劑甘露醇濃度應為0.6 mol/L,從酶解液pH值看, K3＞K2＞K1,說明復合因子和單因子的實驗結(jié)果有差別。

表4 L9(34)試驗結(jié)果Table 4 L9(34)experiment results

綜合試驗分析結(jié)果,B2D2C2A1即酶解溫度為25℃,酶解時間為5 h,滲透壓穩(wěn)定劑為0.6 mol/ L甘露醇,pH值6.5為滑菇原生質(zhì)體制備條件的最優(yōu)組合。

2.3 滑菇菌絲體、子實體、孢子原生質(zhì)產(chǎn)量比較

滑菇的不同生長期及部位在1.5%溶壁酶、OS培養(yǎng)基、菌絲培養(yǎng)13 d、pH 6.5、0.6 mol/L甘露醇、25℃條件下酶解5 h,分別測得原生質(zhì)的產(chǎn)量見表5。由表5可知,菌絲體原生質(zhì)體的產(chǎn)量明顯大于子實體和孢子,它們的排列順序依次為菌絲體、子實體(菌蓋、菌柄、基部)、孢子。

表5 滑菇不同生長期及部位的原生質(zhì)產(chǎn)量比較Table 5 The experiment results about the different part and period of Pholiota nameko

3 討 論

采用菌絲體為原材料,滑菇原生質(zhì)體最佳制備條件:1.5%溶壁酶、OS培養(yǎng)基、菌絲培養(yǎng)13 d、pH 6.5、0.6 mol/L甘露醇、25℃條件下酶解5 h,原生質(zhì)體產(chǎn)量達到4.85×106個/mL。通過滑菇原生質(zhì)體制備研究,為滑菇育種工作打下了基礎(chǔ),但同時也存在如下問題需進一步研究。可嘗試酶解前用疏基乙醇對滑菇菌絲預處理,打開細胞壁中硫鍵,使其對溶壁酶處理更敏感。因孢子生理狀態(tài)比菌絲更易同步化,可嘗試用效果更好的脫壁酶處理孢子以代替菌絲。因滑菇細胞壁結(jié)構(gòu)復雜,各種脫壁酶活性不同,可用幾種脫壁酶組合在一起,溶壁效果會更好。

[1]劉樞同,羅信昌.食用菌生物技術(shù)及應用[M].北京:清華大學出版社,1999:86-124.

[2]邱龍新.食用菌原生質(zhì)體技術(shù)研究現(xiàn)狀[J].龍巖師專學報,2002,20(6):49-51.

Protoplast Preparation of Huagu Mushroom(Pholiota nameko)

CHEN Chao1,MENG Qing-guo1,ZHOU Jian-shu1,YANG Ze-tao1, ZHAO Jie1,HAN Bing1,L I Yang1,TIAN Hao1,WANG Shang-jie2
(1.Liaoning Acad.of Microbiol.Sci.,Chaoyang122000;2.Agric. Sta.,Bajiazi,Eco.Devel.Zone,Huludao125316)

Study on the optimum conditions of preparation of Pholiota nameko(Pn)protoplast indicated that:using OS medium,put hyphae of Pn that had cultured for 13 days into the solution with 1.5%helicase,0.6 mol/L mannitol,pH 6.5,and digested for 5 hours in 25℃,the protoplast output could reach to the highest,and as high as 4.85 ×106/mL.

Pholiota nameko;protoplast;preparation

S646.1+6

B

1005-7021(2010)06-0089-04

陳超 男,研究實習員。主要從事食用菌研究工作。Tel:0421-2976895

2010-10-19;修回日期:2010-11-20