黃敏婷,陸 春

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣東廣州 510630)

生物膜胞外聚合物的檢測(cè)技術(shù)與功能的研究進(jìn)展

黃敏婷,陸 春＊

(中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院,廣東廣州 510630)

生物膜胞外聚合物是黏附在生物膜周圍,保證生物膜功能及完整性的生物合成聚合物。近幾年,生物膜胞外聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)、生物功能及其檢查技術(shù)備受關(guān)注。就生物膜胞外聚合物的組成、檢測(cè)技術(shù)及功能幾方面展開綜述。

生物膜胞外聚合物;組成;研究方法與技術(shù);功能

生物膜胞外聚合物(extracellular polymeric substances,EPS)是一種在生物膜中,使細(xì)胞與其他特殊物質(zhì)凝聚、結(jié)合在一起的有機(jī)生物合成聚合物,主要黏附在微生物生物膜周圍,保證生物膜功能及完整性的物質(zhì)。EPS的產(chǎn)生是自然環(huán)境中生物膜的普遍特性,在原核與真核生物中均可發(fā)現(xiàn)[1]。本文就EPS近期的研究?jī)?nèi)容展開綜述。

1 EPS的組成成分與其影響因素

EPS是三維的、膠樣的、高度水合的混合物,主要由多種有機(jī)高分子物質(zhì)組成,如多糖、蛋白、核酸、磷脂、褐藻酸、腐殖質(zhì)以及其他多聚混合物,其中也不乏一些低分子無機(jī)物,如硫酸鹽等,它們?cè)谀撤N程度上可極大地改變生物膜的結(jié)構(gòu)與物理化學(xué)性質(zhì)。EPS中的糖類主要包含:單糖、糖醛酸、氨基糖等;磷脂類包含:脂肪酸、甘油、磷酸酶、氨基乙醇、絲氨酸、膽堿等;腐殖質(zhì)類包含酚類混合物等,不同種類的微生物群體,EPS成分有所不同[1]。Tsuneda[2]對(duì)27種異養(yǎng)需氧菌EPS的組成進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)多糖和蛋白質(zhì)為EPS主要成分,占整個(gè)EPS質(zhì)量的75%～89%,且多糖中的己糖、己糖胺、酮糖占有相當(dāng)高的比重。從油井分離出來的一種嗜熱細(xì)菌MS-1[3],其EPS也含有48.3%～54.5%多糖,多糖中甘露糖、葡萄糖、半乳糖的比例為2.04∶1.00∶0.89;而蛋白類占EPS的37.2%～42.4%,包括蛋氨酸、亮氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、組胺酸和絲氨酸。而Jabbouri[4]認(rèn)為EPS的性質(zhì)與成分的多樣性取決于微生物種類和培養(yǎng)條件,其研究發(fā)現(xiàn)多聚N-乙酰葡糖胺(PNAG)是表皮葡萄球菌EPS的主要成分,除PNAG和蛋白外,胞外磷壁質(zhì)也是表皮葡萄球菌生物膜中一種新的組分。D′Abzac[5]從4種厭氧顆粒污泥的EPS中提取到了9種物質(zhì),主要為腐殖酸類物質(zhì)、蛋白和多糖,其中小部分重要的無機(jī)物可占EPS干燥重量的22%～70%?？梢?微生物種類決定了EPS的主要成分,但對(duì)多數(shù)的EPS而言,多糖與蛋白類物質(zhì)仍然占了相當(dāng)大的比例,因此,可根據(jù)不同微生物群體的EPS成分不同,有目的選擇不同的標(biāo)記物對(duì)EPS進(jìn)行研究。

EPS的成分來源于不同的途徑,如細(xì)胞活動(dòng)分泌、細(xì)胞表面分泌、細(xì)胞溶解以及從外界環(huán)境吸收等,故影響以上途徑的因素均可影響EPS的組成。Mitik-Dineva[6]研究了5種海洋細(xì)菌在2種玻璃表面的增殖情況,結(jié)果顯示5種細(xì)菌在化學(xué)蝕刻、光滑的納米玻璃表面黏附能力均增強(qiáng),EPS分泌水平也相應(yīng)增高,說明在不同材料上所形成的生物膜其EPS的組成也不相同。Jang[7]在比較硝化和去硝化2種情況下生物膜的變化時(shí),發(fā)現(xiàn)去硝化作用可減少EPS的濃度(主要是可溶性的蛋白及高分子量碳水化合物濃度)和降低生物膜的疏水性,從而導(dǎo)致沉淀絮狀物老化,影響生物膜的生物特性,說明不同的生物膜培養(yǎng)條件對(duì)EPS的組成也可造成重要影響。所以,在研究不同處理方式下對(duì)EPS的影響時(shí),需考慮培養(yǎng)條件及環(huán)境等因素的影響。

2 EPS的研究方法與技術(shù)

EPS的檢測(cè)技術(shù)主要有破壞性及非破壞性分析2種[1]。破壞性分析主要指通過各種方法提取出EPS主要成分,再運(yùn)用各種技術(shù)對(duì)提取物進(jìn)行分析研究,如D′Abzac[8]研究發(fā)現(xiàn)EPS提取物中的無機(jī)物成分及含量,極大地依賴于不同的提取方法和厭氧污泥的不同種類,使用離心法、超聲波降解法、加熱提取法均可獲得相似的無機(jī)物構(gòu)成比,而陽離子樹脂交換法可使EPS提取物中的鈉離子含量增加,化學(xué)提取法則容易使提取物被雜質(zhì)或萃取劑污染。Ni[9]利用凝膠滲透色譜法(GPC)、熒光三維激發(fā)/發(fā)射矩陣光譜技術(shù)(EEM)和數(shù)學(xué)建模,對(duì)活性污泥中微生物所產(chǎn)生的EPS性質(zhì)進(jìn)行研究,結(jié)果可觀察到EPS提取物的色彩層析譜中存在7個(gè)波峰,其中3個(gè)為多糖類物質(zhì),4個(gè)為蛋白類物質(zhì)。Simon[10]提出利用尺寸排阻色譜法(SEC)及2個(gè)串連的色譜柱,對(duì)厭氧污泥顆粒中提取出來的EPS進(jìn)行分析,可獲得更詳細(xì)的層析譜。而Park[11]的研究則說明了宏蛋白質(zhì)組學(xué)(Metaproteomic)分析法是深入研究活性污泥EPS中蛋白質(zhì)的有效方法,Metaproteomic分析法的原理主要是應(yīng)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離純化,后再通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/ MS)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和分析。這些技術(shù)雖然都有利于EPS主要成份的深入研究,但對(duì)EPS造成了不可逆的破壞而不利于動(dòng)態(tài)觀察。

在非破壞性分析方面,有電子顯微鏡、掃描探針技術(shù)、磁共振光譜法、共聚焦激光掃描顯微鏡等技術(shù)[1]。如Adav[12]提出選用7種不同的熒光染料,即標(biāo)記核酸的SYTOX藍(lán)、標(biāo)記脂質(zhì)的尼羅紅、標(biāo)記β-多糖的卡爾科弗盧爾白、標(biāo)記α-聚糖的伴刀豆球蛋白A、標(biāo)記蛋白的異硫氰酸熒光素、標(biāo)記活細(xì)胞的SYTO63、用于監(jiān)測(cè)鈣水平的鈣綠,對(duì)EPS的不同成分進(jìn)行原位雜交標(biāo)記后,采用共聚焦激光掃描顯微鏡(CLS M)和MATLAB軟件,可對(duì)EPS進(jìn)行定位、定量分析。有研究[3]說明透射電子顯微鏡、環(huán)境掃描電子顯微鏡也可用于高溫情況下(如油田)觀察微生物膜的輪廓以及EPS的形態(tài)結(jié)構(gòu)。而Quilès[13]使用衰減全反射—傅里葉變換紅外光譜技術(shù)(ATR-FTI R),觀察到浮游細(xì)菌的代謝情況和生物膜形成的初始階段,還發(fā)現(xiàn)蛋白、核酸和多糖的ATR-FTIR光譜數(shù)據(jù)變化與浮游細(xì)菌的生長(zhǎng)、生理狀態(tài)的改變相關(guān)聯(lián),提示這一過程可能伴隨EPS主要成份的產(chǎn)生。Ivleva[14]則提出一種無需標(biāo)記的極有潛質(zhì)的非破壞性檢測(cè)EPS的技術(shù)——拉曼顯微鏡技術(shù)(RM),利用RM可研究不同種類生物膜的化學(xué)性質(zhì),包括微生物的組分和EPS,主要原理為RM可與各種不同結(jié)構(gòu)的生物膜相互作用,分析其化學(xué)成分及提供化學(xué)相關(guān)信息,其結(jié)果與CLS M分析結(jié)果有著較好的一致性,將兩者聯(lián)合更有利于生物膜成分復(fù)雜結(jié)構(gòu)的深入研究。上述檢測(cè)技術(shù)均有利于直觀認(rèn)識(shí)EPS的形態(tài)和結(jié)構(gòu),并能在各種處理下對(duì)EPS進(jìn)行較好的動(dòng)態(tài)追蹤及觀察,但是,在未知生物膜EPS主要成分的情況下,所選用的標(biāo)記物能否特異性的結(jié)合目標(biāo)物質(zhì),以及能否得到較全面的標(biāo)記物對(duì)EPS各種成分進(jìn)行標(biāo)記等問題,尚待進(jìn)一步解決。

3 EPS的功能與意義

EPS主要負(fù)責(zé)生物膜結(jié)構(gòu)與功能的完整性,是決定生物膜物理化學(xué)與生物學(xué)性質(zhì)的關(guān)鍵。EPS形成的膠樣網(wǎng)狀系統(tǒng),有利于維持生物膜菌體相互凝聚在一起,調(diào)節(jié)生物膜表面的黏附,參與感染的建立,以及保護(hù)細(xì)菌免受環(huán)境中有害物質(zhì)的侵?jǐn)_。關(guān)于EPS還可能存在的功能,概括如表1[1]。

表1 EPS可能存在的功能Table 1 Selection of proposed effects due to microbial EPS

因EPS具有吸附能力(解毒作用),使得EPS常用于環(huán)境治理、污水凈化等方面,如Kong[15]對(duì)4種不同的活性污泥的EPS(包括可溶解的和固定的)吸收染料酸性湖藍(lán)A的能力進(jìn)行研究,結(jié)果顯示干燥厭氧污泥顆粒的吸收能力最強(qiáng),且不同種類的污泥中可溶解和固定的EPS吸收能力也不相同,提示選用合適的菌種和反應(yīng)模型可提高EPS的去污凈化能力。而Tourney[16]在研究EPS的物理化學(xué)性質(zhì)對(duì)鋅離子吸附的影響時(shí),卻發(fā)現(xiàn)移除EPS對(duì)金屬離子吸附能力的影響并不大,且EPS產(chǎn)生的溶解性有機(jī)碳(DOC)可降低生物膜對(duì)金屬離子的吸收,提示工業(yè)應(yīng)用中生物膜反應(yīng)器里過量的EPS可能降低金屬離子的清除效率。在醫(yī)學(xué)方面,致病微生物生物膜的形成是慢性感染、耐藥性產(chǎn)生等問題的重要原因之一,對(duì)致病微生物生物膜EPS功能的研究和利用,往往有助于消除生物膜或阻止生物膜形成。如I wai[17]研究發(fā)現(xiàn)極端嗜熱菌生物膜EPS的主要成分飽和硅酸,可以促進(jìn)細(xì)胞之間及細(xì)胞與培養(yǎng)皿間的相互作用,從而形成生物膜結(jié)構(gòu);并包繞生物膜細(xì)胞表面發(fā)揮維持生物膜完整性的功能。在保持生物膜完整性的基礎(chǔ)上,EPS還可改變自身的組成與生物特性以協(xié)助生物膜系統(tǒng)適應(yīng)環(huán)境的變化,如粘液性銅綠假單胞菌[18]在生物膜形成時(shí)可產(chǎn)生一些胞外酶,如EstA、LasB、LipC,可影響生物膜的形成與空間分布以適應(yīng)環(huán)境的變化。同時(shí),EPS有利于細(xì)菌抵抗宿主免疫的功能:Wagner[19]發(fā)現(xiàn)嗜中性粒細(xì)胞(P MN)趨于黏附生長(zhǎng)階段的銅綠假單胞菌生物膜,成熟的生物膜因不分泌3OC12-HSL而對(duì)PMN無趨化作用,其一系列的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了成熟與生長(zhǎng)階段的生物膜主要區(qū)別在于EPS中海藻酸鹽的有無,但生物膜深層細(xì)胞逃避宿主免疫攻擊主要原因還是成熟生物膜的EPS限制了PMN的穿透,說明EPS有保護(hù)生物膜內(nèi)部細(xì)菌、抵抗宿主免疫的屏障功能。還有研究[20]將可以表達(dá)生物膜降解酶的噬菌體轉(zhuǎn)染至生物膜中的大腸埃希菌細(xì)胞內(nèi),重組噬菌體在細(xì)胞內(nèi)大量復(fù)制并表達(dá)溶解酶DspB,最終致細(xì)菌溶解及EPS降解,生物膜被清除,體現(xiàn)了EPS在形成及維持生物膜狀態(tài)中起著必不可少的作用。

4 結(jié) 語

由于生物膜廣泛存在于日常生活、生產(chǎn)環(huán)境中,對(duì)生物膜胞外聚合物進(jìn)行深入研究、了解生物膜的物理化學(xué)性質(zhì)及生物特性,有助于人們將其靈活應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)、食品制造、污水處理、醫(yī)學(xué)行業(yè)等各種領(lǐng)域,尤其是胞外聚合物在致病微生物生物膜中所起作用的深入研究,對(duì)醫(yī)學(xué)上的臨床治療問題有著重要的指導(dǎo)意義。

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Detection and Function of Bio-Membrane Extracellular Polymer

HUANG Min-Ting,LU Chun
(The Third Affil.Hosp.of Sun Yat-sen Uni.,Guangzhou510630)

Bio-membrane extracellular polymer(BMEP)is a bio-synthesis polymer that sticks and attaches to the bio-membrane to assure the function and integrity of bio-membrane.Recently physicochemical and biological properties of BMEP and its detection technique were deeply paid close attention to.The components of BMEP,its detection technique,functions and other aspects were summarized in this article.

bio-membrane extracellular polymer(BMEP);component;detection method;function

Q73;Q93-33

A

1005-7021(2010)06-0082-04

黃敏婷 女,碩士研究生。研究方向?yàn)槠つw病與性病。Tel:020-85253017,E-mail:huangminting1985@yahoo.com.cn

＊通訊作者。E-mail:pifuke@126.com

2010-10-24;

2010-11-19