賀軍軍,羅 萍＊,陳永輝,易潤華,李勤奮

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院湛江實驗站,廣東湛江 524013;2.廣東海洋大學,廣東湛江 524088; 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所,海南儋州 571737)

菠蘿渣淀粉功能降解菌篩選及s2b7-4的鑒定

賀軍軍1,羅 萍1＊,陳永輝1,易潤華2,李勤奮3

(1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院湛江實驗站,廣東湛江 524013;2.廣東海洋大學,廣東湛江 524088; 3.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院環(huán)境與植物保護研究所,海南儋州 571737)

為了加快菠蘿渣發(fā)酵,本試驗通過利用多種選擇性培養(yǎng)基,從自然發(fā)酵的菠蘿渣中分離到多種淀粉分解菌,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,獲得了降解菠蘿渣的淀粉降解功能菌株s2b7-1和s2b7-4,篩選出其最適培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基及其優(yōu)化組合。通過形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出s2b7-4菌株為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

菠蘿渣;淀粉功能降解菌;s2b7-4

菠蘿原名鳳梨,原產(chǎn)巴西,目前已廣泛分布在南北回歸線之間,成為世界重要的果樹之一。16世紀時傳入我國,在廣東、廣西、福建、臺灣等地區(qū)大面積栽培種植,種植面積達70000 hm2左右[1]。然而,由于菠蘿保存期較短,收獲后常用來加工罐頭、濃縮汁和蜜餞等,而占全果重50%～60%的菠蘿皮副產(chǎn)品多被堆積廢棄,造成環(huán)境污染和資源浪費[2-3]。近年來,隨著國內(nèi)對廢棄物綜合利用的開發(fā),菠蘿加工副產(chǎn)品在肥料化方面的利用越來越受到重視,但多是通過自然堆放發(fā)酵制備有機肥,存在所用時間長、發(fā)酵臭氣難處等問題。本研究從微生物加快菠蘿渣發(fā)酵熟化的角度出發(fā),通過對不同堆放時間的菠蘿渣中的微生物進行分離、純化和篩選,選出其中的高效降解淀粉菌株,并對其最佳功能培養(yǎng)基進行了篩選及優(yōu)化,以期為菠蘿渣肥料化的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 菠蘿渣采自廣東省豐收糖業(yè)發(fā)展有限公司堆積場。

1.1.2 培養(yǎng)基 淀粉培養(yǎng)基(S1):(NH4)2SO42.5 g,KH2PO42.5 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;淀粉蛋白胨酵母培養(yǎng)基(S2):MgSO40.5 g,KH2PO40.1 g,淀粉12 g,蛋白胨8 g,酵母粉2 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.0;牛肉膏蛋白胨淀粉培養(yǎng)基(S3):NaCl5 g,淀粉2 g,蛋白胨10 g,牛肉膏3 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良營養(yǎng)肉湯:牛肉膏10 g,蛋白胨5 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0～7.2;改良IFFI24M:NaCl 5 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉10 g,酵母膏5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.8;改良NA:NaCl 5 g,牛肉膏3 g,蛋白胨5 g,淀粉15 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 6.6～7.0;改良LB:NaCl 5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良YPG:NaCl 5 g,玉米粉7 g,蛋白胨20 g,淀粉15 g,酵母膏10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良BPY:馬鈴薯200 g,牛肉膏5 g,蛋白胨10 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;改良PDA:馬鈴薯200 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL pH自然;改良BPDB:馬鈴薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉10 g,葡萄糖5 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.0;BPsB:馬鈴薯200 g,牛肉膏20 g,淀粉20 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL, pH自然;淀粉培養(yǎng)基:KH2PO40.3 g,MgCO31 g, NaNO31 g,淀粉10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH自然;蛋白胨淀粉培養(yǎng)基:蛋白胨0.1 g,淀粉5 g,葡萄糖1 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL, pH自然;酵母膏淀粉培養(yǎng)基:淀粉5 g,酵母膏10 g,瓊脂15 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2。分離降解細菌用S1、S2和S3等培養(yǎng)基;菌株篩選用改良營養(yǎng)肉湯、改良IFFI24M、改良NA、改良LB、改良YPG、改良BPY、改良PDA、改良BPDB、BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培養(yǎng)基。

1.2 方法

1.2.1 分離與篩選 稱取菠蘿渣樣品1.00 g,加入無菌水10 mL,在振蕩機上振蕩10 min,形成懸液,吸取1 mL懸液依10倍法稀釋到10-6,取10-6稀釋懸液0.1 mL分別涂布到S1、S2和S3培養(yǎng)基上;28℃黑暗培養(yǎng)4 d,計算菌落數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落,按常規(guī)方法純化后保存。菌株篩選采取透明圈法。將分離得到的菌株接種到淀粉培養(yǎng)基平板上,28℃培養(yǎng)24 h后,取出平板,滴加碘液,測量透明圈和菌落的直徑大小,挑選透明圈和菌落的直徑比值較大的菌株保存?zhèn)溆?將初篩獲得的菌株在淀粉培養(yǎng)基平板進一步篩選得到淀粉降解功能菌株。

1.2.2 功能培養(yǎng)基篩選 用改良營養(yǎng)肉湯、IFFI24M、NA、LB、YPG、BPY、PDA、BPDB和BPs B、淀粉、蛋白胨淀粉、酵母膏淀粉等培養(yǎng)基,進行功能培養(yǎng)基篩選,每處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 功能培養(yǎng)基優(yōu)化 對功能培養(yǎng)基成分按照正交試驗L9(3)3進行優(yōu)化,每處理設(shè)3個重復(fù)。

1.2.4 s2b7-4菌株鑒定 ①常規(guī)鑒定:對菌株的菌落形態(tài),菌體形狀、革蘭染色、芽胞染色、耐鹽性、硝酸還原、檸檬酸鹽利用、H2S產(chǎn)生、纖維素分解、明膠液化、淀粉水解、吲哚產(chǎn)生、過氧化氫酶產(chǎn)生、V-P反應(yīng)以及不同碳源的利用等生長培養(yǎng)特性及生理生化進行了測定。具體參照《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[4]和《伯杰氏細菌鑒定手冊》第8版[5]等文獻;②16S r DNA序列分析:改良的SDS法提取降解菌株s2b7-4和s2b7-1的基因組DNA為模板,以16(+)5-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3,16(-)5-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CT-3為上下游引物擴增菌株的16S rDNA。其PCR體系為(25μL):模板2μL,上游引物1 μL,下游引物1μL,10×buffer 2.5μL,Mg(25 mmol/L)2.5μL,DNTP(2 mmol/L)2.5μL,Taq (3 U/μL)0.35μL,ddH2O 13.15μL。PCR擴增條件:94℃預(yù)變性4 min,94℃變性1 min,50℃退火0.5 min,72℃延伸0.5 min,循環(huán)35次;最后72℃保溫10 min。瓊脂糖凝膠電泳并回收目標DNA片段,由大連寶生物工程有限公司完成測序,測序結(jié)果用BLAST軟件在GenBank進行同源性比較,以Clustal X進行多序列比對后,用MEGA 4.0的Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并進行1000次Bootstraps檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 淀粉降解菌株的分離

從表1可以看出,相同樣品在淀粉培養(yǎng)基(S1)中出現(xiàn)菌落數(shù)最多,平均為11.5×107cfu/ g,顯著高于淀粉蛋白胨酵母培養(yǎng)基(S2)和牛肉膏蛋白胨淀粉培養(yǎng)基(S3)的0.25×107cfu/g和0.25×107cfu/g。

表1 培養(yǎng)基對淀粉降解菌分離的影響(單位:107cfu/g)Table 1 Effect of starch degradation strains in different mediums(Unit:107cfu/g)

2.2 功能菌株篩選

采用透明圈法對淀粉降解菌進行篩選,從菠蘿渣中分離了47個菌株,其中40個菌株沒有任何降解能力。7個菌株有降解能力,其透明圈直徑與菌落直徑的比值在0.55～4.0,占分離比例的14.89%(表2)。7個功能菌株中,s2b7-4的比值最大為4.0,s2b7-1次之為2.57。

表2 菠蘿渣淀粉降解菌的篩選Table 2 Screening of starch degrading-bacteria in pineapple residue

2.3 功能菌株復(fù)篩

通過采用透明圈法對獲得的初始功能菌株進行復(fù)篩,從而確定淀粉降解功能菌株。實驗表明: s2b7-4和s2b7-1菌株的HC值顯然比其他菌株的大,分別為3.75和2.63,被確定為淀粉功能降解菌株(表3)。

2.4 功能培養(yǎng)基篩選

利用功能菌株在不同培養(yǎng)基上的HC值來評價菌株功能發(fā)揮的最適培養(yǎng)基。由表4可知: s2b7-1和s2b7-4菌株HC值在12種不同培養(yǎng)基表現(xiàn)不一,均在改良LB培養(yǎng)基上HC值最大,分別為5.05和2.43。故認為改良LB培養(yǎng)基是s2b7-1和s2b7-4菌株功能培養(yǎng)基。

表3 淀粉降解功能菌株篩選Table 3 Screening of starch degrading-bacteria

表4 s2b7-1和s2b7-4菌株在不同培養(yǎng)基HC值Table 4 HC value of s2b7-1 and s2b7-4 strains in different mediums

2.5 功能培養(yǎng)基優(yōu)化

對s2b7-1和s2b7-4菌株的功能培養(yǎng)基即改良LB培養(yǎng)基中的蛋白胨、NaCl和酵母膏用量進行優(yōu)化,其優(yōu)化組分水平如表5所示。試驗結(jié)果表明,s2b7-1菌株的最佳培養(yǎng)基為組合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏5 g,NaCl 5 g,瓊脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大為4(表6);s2b7-4菌株的最佳培養(yǎng)基為組合:蛋白胨5 g,淀粉5 g,酵母膏2.5 g,NaCl 2.5 g,瓊脂15 g,水1000 mL,pH 7.0,其HC值最大為3.08(表7)。

表5 培養(yǎng)基優(yōu)化組分水平Table 5 Medium optimization component level

表6 s2b7-1菌株功能培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果Table 6 Medium optimization results of s2b7-1 strain

2.6 s2b7-1和s2b7-4菌株優(yōu)化培養(yǎng)基的酶活

通過對s2b7-1和s2b7-4菌株分別在優(yōu)化培養(yǎng)基上的淀粉降解酶的測定發(fā)現(xiàn):s2b7-1和s2b7-4菌株的酶活性分別為216.46μg/(mL· min)和313.71μg/(mL·min),因此,綜合初篩、復(fù)篩和酶活性測定,得出s2b7-4菌株對淀粉具有較強的降解能力。

2.7 功能菌株鑒定

2.7.1 形態(tài)特征 形態(tài)觀察發(fā)現(xiàn),s2b7-4菌落為圓形,黃色不透明,隨著培養(yǎng)時間的延長,菌落變厚、變干,邊緣鋸齒狀,菌落上有褶皺狀突起,顏色變?yōu)闇\棕黃色;菌體直桿狀,大小為0.75μm× 2.10μm,周生鞭毛,革蘭染色陽性;產(chǎn)芽胞。表明該菌株為芽胞桿菌(Bacillus sp.)。

2.7.2 生理生化特征 菌株s2b7-4生理生化測定結(jié)果(表8),菌株s2b7-4生長溫度范圍為15～45℃,生長的pH范圍為5～9,能夠耐受5%的氯化鈉和0.001%的溶菌酶,參照文獻[4-5],表明該菌株與枯草芽胞桿菌的特征基本相似,因此,菌株可能為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

表8 s2b7-4菌株的生理生化特征Table 8 Physiological and biochemical characteristics of s2b7-4 strain

2.7.3 分子鑒定 提取菌株s2b7-4基因組DNA,通過PCR得到菌株1.5 kb左右的16S rDNA。委托寶生物工程(大連)有限公司測得s2b7-4的16S rDNA部分序列,長度為1461 bp。通過BLAST比較發(fā)現(xiàn):s2b7-4的16S r DNA序列與芽胞桿菌屬細菌的16S r DNA相似,調(diào)出其中已鑒定菌株的16S rDNA,用Clustal W進行多重序列對比,用軟件MEGA 4.0按Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。菌株與枯草芽胞桿菌B.subtilissub sp.subtilis IAM 12118T(AB042061)關(guān)系最緊密,位于同一分支中,同源性高達99.4%。結(jié)合s2b7-4形態(tài)特征、培養(yǎng)特征及生理生化指標測定等表型鑒定結(jié)果,初步將s2b7-4菌株鑒定為枯草芽胞桿菌(Bacillus subtilis)。

圖1 鄰接法構(gòu)建的s2b7-4菌株16S rDNA序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Phytogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of s2b7-4 strain

3 討 論

本文以菠蘿渣堆肥所需菌劑的開發(fā)為主,通過對多種分離源的淀粉降解菌進行分離、純化和篩選,獲得了1株淀粉降解功能菌株,并對其最佳培養(yǎng)基進行篩選。通過試驗得出以下結(jié)論:①利用多種選擇培養(yǎng)基,經(jīng)過初篩和復(fù)篩,從自然發(fā)酵不同階段的菠蘿渣中獲得了2株淀粉降解菌株s2b7-1和s2b7-4;②s2b7-1和s2b7-4菌株最佳功能培養(yǎng)基為改良LB培養(yǎng)基,并對培養(yǎng)基進行了優(yōu)化,通過優(yōu)化培養(yǎng)基上的淀粉酶活測定發(fā)現(xiàn), s2b7-4菌株對淀粉降解具有較好的功效;③通過形態(tài)、生理生化和分子綜合鑒定得出s2b7-4菌株為枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis。

[1]鄧干然,張勁,李明福,等.我國菠蘿葉纖維發(fā)展前景分析[J].中國麻業(yè)科學,2009,31(4):274-277.

[2]黃發(fā)新,詹云輝.菠蘿皮渣釀制白蘭地的初步研究[J].廣西熱作科技,1997,(2):31-35.

[3]楊禮富,謝貴水.菠蘿加工廢料—果皮渣的綜合利用[J].熱帶農(nóng)業(yè)科學,2002,22(4):61-70.

[4]東秀珠,蔡妙英.常見細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[5]RE布坎南,NE吉本斯.伯杰細菌鑒定手冊(第8版)[M].北京:科學出版社,1984.

Screening of Functional Starch-Degrading Bacteria from Pineapple Dregs and Identification of s2b7-4

HE Jun-jun1,LUO Ping1,CHEN Yong-hui1,YI Run-hua2,L IQin-fen3
(1.Zhanjiang Res.Sta.,CATAS,Guangdong,524013;2. Guangdong Ocean Uni.,Zhanjiang,Guangdong,524088; 3.Envir.&Plant Prot.Res.Inst.,CATAS,Danzhou,Hainan,571737)

In order to accelerate the fermentation of pineapple residue,multiple starch-degrading bacteria were isolated from naturally fermented pineapple dregs using selective media in this experiment.Functional strains s2b7-1 and s2b7-4 that were capable of degrading starch in pineapple residue,were obtained through screening and re-screenings, an improved the most suitable medium LB and its optimized combination were also screened.Strain s2b7-4 was identified comprehensively as Bacillus subtilis according to its morphological,physiological,bio-chemical and molecular characteristics.

pineapple residue;functional starch-degrading bacteria;s2b7-4

Q93-331

A

1005-7021(2010)06-0060-05

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項資金環(huán)境與植物保護研究所資助項目(2009hzs1J033)

賀軍軍 男,研究實習員。研究方向為資源開發(fā)與利用。Tel:0759-2192696,E-mail:hbj46@163.com

＊通訊作者。Tel:0759-2166419,E-mail:luoping428@163.com

2010-10-23;

2010-11-12