董迎輝, 陳 杰, 林志華, 胡利華, 孫長森

（1. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315100; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005;3. 臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 臨海 317000）

青蛤受精和早期卵裂過程中核相的細(xì)胞學(xué)變化

董迎輝1, 陳 杰1, 林志華1, 胡利華2, 孫長森3

（1. 浙江萬里學(xué)院 生物與環(huán)境學(xué)院, 浙江 寧波 315100; 2. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005;3. 臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院, 浙江 臨海 317000）

利用Hoechst 33258染色、熒光顯微鏡觀察方法, 對青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））受精和早期卵裂過程中的核相變化進(jìn)行了細(xì)胞學(xué)研究。結(jié)果表明: 青蛤成熟未受精卵呈圓球形, 核內(nèi)同源染色體排列整齊, 核相處于第一次成熟分裂中期。在水溫25～26℃條件下進(jìn)行人工授精, 精卵混合后, 精子迅速附著于卵子表面; 受精后5～10 min, 精子進(jìn)入卵內(nèi)并明顯膨脹成球形; 分別在10～15 min、20～25 min受精卵進(jìn)行兩次成熟分裂, 排出第一、第二極體; 30 min左右, 精、卵核體積膨脹, 形成彌散狀的雌、雄原核; 35 min, 雌、雄原核在卵子中央發(fā)生原核聯(lián)合, 染色體共同排列在紡錘體的赤道板上, 形成第一次有絲分裂的中期分裂相; 40～45 min, 受精卵進(jìn)行第一次卵裂, 形成 2個(gè)大小不等的分裂球; 55～60 min, 第二次卵裂結(jié)束, 形成1大3小4個(gè)卵裂球, 卵裂過程中的核相變化與第一次卵裂基本相同;70 min左右, 胚胎開始第三次卵裂。另外, 在青蛤受精過程中發(fā)現(xiàn)了約1%的多精入卵現(xiàn)象, 且入卵精核均能形成雄原核, 但多精受精對成熟分裂和有絲分裂過程有很大影響, 往往造成成熟分裂紊亂和第一次卵裂染色體分離異常。

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））; 受精; 早期卵裂; 多精入卵; 細(xì)胞學(xué)觀察

青蛤（Cyclina sinensis（Gmelin））是中國南北沿海習(xí)見的經(jīng)濟(jì)貝類, 其肉味鮮美、營養(yǎng)豐富, 且有清熱利濕、化痰散結(jié)之功效[1], 歷來是沿海居民喜食的海鮮佳品。20世紀(jì)80年代, 青蛤的土池育苗[2]和室內(nèi)人工育苗[3]相繼取得成功, 育苗技術(shù)的突破與逐漸成熟為青蛤養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。加之青蛤具有生長快、適應(yīng)性廣和抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn), 在沿海灘涂具有廣闊的養(yǎng)殖發(fā)展前景。有關(guān)青蛤的繁殖和發(fā)育的研究已經(jīng)見諸報(bào)道, 如曾志南等[4～6]對青蛤的繁殖周期、卵母細(xì)胞發(fā)育過程及精細(xì)胞分化等進(jìn)行了研究; 高悅勉等[7]用掃描電鏡和透射電鏡觀察了青蛤精子的形態(tài)和超微結(jié)構(gòu); 孫晉廷等[2]、沈?qū)毱降萚8]用普通光鏡對青蛤胚胎發(fā)育過程進(jìn)行了觀察和描述; 白胡木吉力圖等[9]用常規(guī)石蠟切片方法對青蛤卵子的受精和第一次卵裂過程進(jìn)行了研究。然而, 目前青蛤的規(guī)?；斯び缂夹g(shù)并不穩(wěn)定, 許多受精和發(fā)育機(jī)理尚不清楚, 亟需開展大量深入的基礎(chǔ)研究。本實(shí)驗(yàn)采用熒光顯微術(shù)對青蛤受精及早期胚胎發(fā)育過程中的成熟分裂、雌雄原核結(jié)合、早期卵裂等一系列細(xì)胞學(xué)事件進(jìn)行了研究和探討, 以期為青蛤受精機(jī)制的深入研究、規(guī)模化人工育苗以及細(xì)胞工程育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)于2009年6～7月在浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所清江科研基地進(jìn)行。所用青蛤親貝取自臺州溫嶺, 殼高5～7 cm。熒光染色試劑盒Hoechst 33258（包括固定液、Hoechst熒光染料、抗淬滅劑）購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 方法

選擇性腺飽滿的青蛤親貝, 雌性卵巢呈粉紅色,雄性精巢呈乳白色或乳黃色。采用陰干、流水刺激結(jié)合升溫的方法催產(chǎn), 分別挑出剛產(chǎn)的雌、雄個(gè)體,經(jīng)淡水沖洗后單個(gè)放入1 L的燒杯中, 加入600 mL過濾海水, 讓其產(chǎn)卵、排精。選擇鏡檢質(zhì)量好的精、卵, 在水溫25～26℃條件下進(jìn)行人工授精和孵化。

從受精開始, 60 min內(nèi)每隔 5 min取樣一次,60～120 min, 每隔 10 min取樣一次, 每次取卵量不少于1 000粒。樣品用4%多聚甲醛溶液固定2次, 保存于4℃冰箱中。觀察前先用0.1 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.2）沖洗樣品2～3次, 滴加Hoechst 33258熒光染料在黑暗環(huán)境下染色10 min, 再用磷酸緩沖液沖洗2次, 然后將卵液滴于載玻片上, 加1滴抗淬滅劑, 用蓋玻片輕微壓片, 在Nikon 80i熒光顯微鏡的紫外光（365 nm）下觀察, CCD（Charge Coupled Device, 電荷耦合元件）圖像采集系統(tǒng)拍照, 每個(gè)樣品觀察卵數(shù)為100粒。

實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 精卵形態(tài)和精子入卵

在熒光顯微鏡下, 青蛤成熟未受精卵呈圓球形,卵徑 80～90 μm, 卵質(zhì)被染成淺藍(lán)色, 染色體呈亮藍(lán)色, 此時(shí)核相處于第一次成熟分裂中期, 雙價(jià)染色體粗短明顯（圖 1-1）。精子則僅能觀察到頭部濃縮的染色質(zhì)發(fā)出亮藍(lán)色熒光, 呈辣椒狀, 約 3 μm 長（圖1-2）。

在水溫 25～26℃、pH8.0～8.2的條件下進(jìn)行人工授精, 嚴(yán)格控制精卵比例。精、卵混合后, 精子迅速附著于卵子表面, 并逐漸斜插入卵膜, 入卵部位隨機(jī)（圖1-3）。受精后5 min左右, 精子的頭部已經(jīng)進(jìn)入卵胞質(zhì)中, 并明顯膨大成直徑5～6 μm的近球形結(jié)構(gòu)（圖 1-4）。

2.2 兩次成熟分裂

精子入卵啟動(dòng)成熟分裂, 在受精后 10～15 min,受精卵進(jìn)行第一次成熟分裂, 同源染色體在紡錘絲的牽拉下逐漸分開, 一組被拉向卵膜, 另一組拉向卵子中央（圖1-5, 6）?？柯涯さ哪墙M染色體逐漸向卵膜外拱, 最后經(jīng)濃縮被排出卵膜之外, 形成第一極體, 從而完成第一次成熟分裂（圖 1-7）。受精后20～25min, 留于卵內(nèi)的那組染色體重新排列于赤道板上, 然后以同樣的方式在第一極體下方發(fā)生第二次成熟分裂, 姐妹染色單體分離, 產(chǎn)生第二極體（圖

1-8, 9）。

2.3 雌、雄原核的形成與結(jié)合

第二次成熟分裂完成以后, 卵子染色體開始膨脹擴(kuò)散, 逐漸形成一團(tuán)由核膜包圍的、松散的染色質(zhì),即為雌原核。在此同時(shí), 精核也發(fā)生第二次膨脹, 形成與雌原核大小、形狀相似的雄原核。一般雌原核的位置靠近極體, 依此可區(qū)分雌、雄原核（圖 1-9）。受精后 30 min左右, 多數(shù)雌雄原核體積達(dá)到最大,呈直徑 13 μm×16 μm的橢圓形結(jié)構(gòu)（圖 1-10）。

雌、雄原核形成以后, 均向卵子中央遷移（圖1-11）。受精后35 min, 兩原核在卵子中央靠近, 但仍可看到中間的核膜（圖 1-12）。隨后二者的核膜破裂,染色質(zhì)凝縮成兩組染色體, 在卵子中央合并, 雌、雄原核以原核聯(lián)合方式的結(jié)合（圖 1-13～15）。聯(lián)合核的染色體整齊地排列在與卵軸垂直的紡錘體的赤道板上, 形成有絲分裂的中期分裂相, 第一次卵裂行將開始（圖 1-16, 17）。

2.4 早期卵裂

受精后40～45 min, 紡錘體微管將染色體拉向兩極（圖 1-18, 19）; 隨著核分裂的進(jìn)行, 卵細(xì)胞的外形在橫向上被拉長, 然后自極體處發(fā)生縱向內(nèi)縊, 形成十分明顯的分裂溝, 將卵細(xì)胞分割成 2個(gè)大小不等的分裂球（圖 1-20, 21）。第一次卵裂結(jié)束后, 兩個(gè)分裂球中的染色體又變?yōu)槿旧|(zhì), 核膜重建, 進(jìn)入有絲分裂的間期（圖1-21）。

受精后50 min左右, 兩個(gè)卵裂球中的染色體細(xì)絲逐漸螺旋變粗, 形成清晰可見的染色體, 核膜破裂, 染色體排列于紡錘體的赤道板上, 形成第二次有絲分裂中期的核相, 第二次卵裂開始（圖 1-22～25）。第二次卵裂與第一次卵裂過程基本相同, 在與第一次卵裂垂直的縱軸方向上發(fā)生不等全裂, 其中大卵裂球的染色體分裂速度較快（圖 1-26～28）。結(jié)果在受精后55～60 min, 卵裂基本結(jié)束, 形成3小1大4個(gè)卵裂球（圖 1-29）。受精后 70 min左右, 胚胎開始第三次卵裂, 大卵裂球的染色體仍分裂較早（圖 1-30～32）。

2.5 多精入卵與染色體異常分離

在受精后 10～15 min, 發(fā)現(xiàn)了約 1%的多精入卵現(xiàn)象, 入卵的精核都能解凝縮膨脹, 膨脹大小與單精入卵精核沒有差別（圖1-33）。受精后30 min左右,觀察到大多數(shù)多精受精的卵子僅排出一個(gè)極體, 精核亦能發(fā)生原核化（圖1-34）, 這表明青蛤多精入卵可以抑制成熟分裂進(jìn)程, 而對精核的原核化過程沒有太大影響。在隨后的發(fā)育中, 雖然多個(gè)雄原核能與雌原核進(jìn)行染色體聯(lián)合, 但在第一次卵裂的核分裂過程中, 常因染色體不能均等分離而導(dǎo)致受精卵發(fā)育的失?。▓D1-35）。

圖1 青蛤受精和早期卵裂過程中核相變化的熒光顯微鏡觀察Fig. 1 Cytological observation of nuclear behavior of fertilization and early cleavage ofCyclina sinensisunder fluorescent microscope

3 討論

3.1 成熟卵母細(xì)胞所處的發(fā)育時(shí)期和雌雄原核的結(jié)合方式

在水生動(dòng)物中, 不同種類成熟未受精卵所處的發(fā)育時(shí)期不盡相同。海膽的成熟卵子已排出兩個(gè)極體, 完成兩次成熟分裂; 魚類、兩棲類的成熟卵已排出一個(gè)極體, 處于第二次成熟分裂中期; 甲殼動(dòng)物及多數(shù)昆蟲的成熟卵尚未排出極體, 處于第一次成熟分裂中期; 而雙殼貝類卵子的成熟分裂還未開始,處于第一次成熟分裂的前期或中期。大多數(shù)雙殼貝類如合浦珠母貝（Pinctada martensii）[10]、櫛孔扇貝（Chlamys farrer）i[11]、泥蚶（Tegillarca granosa）[12]、菲律賓蛤仔（Ruditapes philippinarum）[13]、文蛤（Meretrix meretrix）[14]等受精前的卵母細(xì)胞核相處于第一次成熟分裂中期, 生發(fā)泡已經(jīng)破裂, 粗短的雙價(jià)染色體排列在紡錘體赤道板上, 而大西洋浪蛤（Spisula solidissima）[15]、近江牡蠣（Ostrea rivularis）[16]、太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）[17]、寬殼全海筍（Barnea dilatata）[18]等少數(shù)貝類受精前的卵母細(xì)胞處于第一次成熟分裂前期, 生發(fā)泡尚存在, 經(jīng)過精子入卵的刺激后, 生發(fā)泡破裂并啟動(dòng)第一次成熟分裂。本實(shí)驗(yàn)觀察到青蛤的成熟未受精卵呈圓球形, 生發(fā)泡已經(jīng)破裂, 同源染色體形態(tài)清晰, 核相處于第一次成熟分裂中期, 與櫛孔扇貝、文蛤等大多數(shù)雙殼貝類相同。

貝類雌、雄原核的結(jié)合方式有原核聯(lián)合和原核融合兩種。一般認(rèn)為, 受精前已完成成熟分裂的卵子,其兩性原核以融合的方式結(jié)合; 而受精前尚未完成成熟分裂的卵子, 在受精后父本的染色體組需在卵內(nèi)等待卵子完成成熟分裂, 雌雄原核在卵內(nèi)重新出現(xiàn)后, 才各自獨(dú)立形成染色體組, 以嵌合或聯(lián)合的方式完成兩性原核的結(jié)合[12]。已有的研究表明, 大多數(shù)雙殼貝類如合浦珠母貝[10]、近江牡蠣[16]、太平洋牡蠣[17]、泥蚶[12]、菲律賓蛤仔[13]、文蛤[14]、寬殼全海筍[18]等受精前尚未完成成熟分裂, 雌、雄原核均以原核聯(lián)合的方式結(jié)合, 即雌、雄原核相互靠攏時(shí)核膜不融合, 而以指狀形式相嵌, 隨后兩原核都形成各自的染色體組, 待原核核膜消失后, 兩組染色體聯(lián)合起來形成合子染色體組。僅有櫛孔扇貝等少數(shù)貝類雌、雄原核相互靠近后核膜融合, 染色質(zhì)合并形成合子核。白胡木吉力圖等[9]對青蛤受精卵的組織切片觀察認(rèn)為, 青蛤雌、雄原核融合成合子核, 以染色質(zhì)融合的方式結(jié)合。然而, 由于組織切片技術(shù)方法的限制, 僅能對受精卵某一切面的核相進(jìn)行觀察, 難以觀察到同時(shí)經(jīng)過雌、雄原核的切面, 所以較難確定雌、雄原核的結(jié)合方式。相比之下, 熒光顯微術(shù)能對整個(gè)受精卵的染色質(zhì)變化進(jìn)行多維觀察, 有利于研究雌、雄原核的結(jié)合過程。本研究的結(jié)果發(fā)現(xiàn), 青蛤的雌、雄原核在相互靠近、結(jié)合時(shí)仍然清晰可辨, 核膜不相互融合, 直到兩原核都形成各自的染色體組,證明了其結(jié)合方式為原核聯(lián)合。

3.2 貝類多精受精的主要成因和發(fā)生機(jī)理

貝類在正常受精的情況下, 一般為單精入卵、單精受精, 不僅可為卵子帶來單倍體的遺傳物質(zhì)保持物種正常二倍體的細(xì)胞核, 而且還帶入有絲分裂所必需的中心粒。然而, 在已有細(xì)胞遺傳學(xué)研究的貝類中幾乎都存在多精入卵現(xiàn)象[11～14,16～21], 其形成原因十分復(fù)雜, 可能與不同物種、精卵的成熟度、精卵比例等關(guān)系密切, 如鮑卵對多精受精的抵抗能力較強(qiáng),即使精卵比例增加到 6.6×1041, 多精受精現(xiàn)象也沒有增加[20]; 泥蚶卵對多精受精比較敏感, 精卵比例由2×1021上升到1×1031時(shí), 多精入卵數(shù)明顯增加, 畸形胚胎率和 D形幼蟲率具有極顯著的差異,達(dá)到2×1041時(shí), D形幼蟲率下降到1～4%; 利用太平洋牡蠣剛從卵巢中取出的卵子受精要比在海水中浸泡1 h后的卵子受精獲得的多精入卵數(shù)多得多[19]。另外, 多精入卵還與受精時(shí)的環(huán)境條件如水溫、pH等有關(guān), 如近江牡蠣卵在受精時(shí), 水溫 25℃組的多精入卵現(xiàn)象明顯比28.8℃組多[16]。由此可見, 在貝類人工育苗過程中要防止多精入卵和提高卵子的孵化率, 既要獲得成熟度適宜的精卵并控制精卵比例,還要?jiǎng)?chuàng)造良好的外界受精條件。

海洋無脊椎動(dòng)物阻止多精受精的策略通常有三:（1）阻止精、卵質(zhì)膜融合; （2）改變卵膜結(jié)構(gòu), 阻止精子的附著或穿透; （3）即使造成多精入卵, 僅有1個(gè)精核與卵核融合[16]。海膽阻止多精入卵的機(jī)制主要包括:（1）快封閉反應(yīng): 精子進(jìn)入卵細(xì)胞迅速觸發(fā)膜電位改變, 引起膜外精子與卵細(xì)胞識別和融合障礙; （2）慢封閉反應(yīng): 通過皮層反應(yīng)形成厚而硬的受精膜, 防范多余精子入卵[22]。然而, 對貝類阻止多精入卵的機(jī)制還不太清楚, 孫振興等[23]推測皺紋盤鮑（Haliotis discus hainai）受精時(shí)也是通過卵膜電位的變化阻止早期入卵精子和皮層反應(yīng)使后期到達(dá)精子失去活力。但有些貝類阻滯多精入卵的機(jī)制相對簡單和不完善, 如扇貝的卵黃膜薄, 其外無膠膜層, 卵黃膜舉起形成受精膜時(shí), 結(jié)構(gòu)和厚度基本無變化, 故不能有效阻止多精入卵的發(fā)生[24]。在青蛤的受精過程中,也發(fā)現(xiàn)了極少量的多精入卵現(xiàn)象, 至于其主要通過何種途徑阻止多精入卵, 尚待開展進(jìn)一步研究。

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Received: Mar., 24, 2010

Key words:Cyclina sinensis; fertilization; early cleavage; polyspermy; cytological observation

Abstract:The artificial insemination experiment ofCyclina sinensiswas carried out three times at Qingjiang Field Research Station of Zhejiang Mari-culture Research Institute from June to July in 2009. More than 1000 fertilized eggs and early embryos ofC. sinensisin every developmental stage were fixed by 4% paraformaldehyde and stained by Hoechst 33258 to study the changes of nuclear behavior under the fluorescence microscope. The results of cytological observation indicated that unfertilized mature eggs ofC. sinensiswere globular （80～90 μm in diameter） and remained at the metaphase of the first maturation division. At water temperature of 25～26℃, artificial insemination was conducted. After mixing of sperms and eggs, sperms quickly attached to the surface of the eggs.At 5～10 min after fertilization, sperm has penetrated into cytoplasm of egg and activated the maturation division.The fertilized eggs released the first polar body at 10～15 min and the second polar body at 20～25 min. At about 30 min, sperm nucleus and the haploid female nucleus expanded to their maximum and developed into the male and female pronuclei which were loose and incompact. At 35 min, the male and female pronuclei matched into an association nucleus after their chromosomes formed in the center of egg. Subsequently, the chromosomes of association nucleus arranged on the metaphase plate of first cleavage. At 40～45 min, the chromosomes were separated equally into two daughter cells which were different in size. At 55～60 min, the second cleavage finished and formed four daughter cells, one big and three small. The process of the second cleavage was fundamentally similar to the first cleavage. At about 70min, the third cleavage started. In addition, the abnormal polyspermy about 1% in the process of fertilization was also observed. Though the polyspermy did not affect the formation of male pronucleus, it significantly affected the process of the maturation division and mitotic division as result of abnormal chromosome division.

（本文編輯:梁德海）

Cytological change of nuclear behaviors of fertilization and early cleavage in Cyclina sinensis

DONG Ying-hui1, CHEN Jie1, LIN Zhi-hua1, HU Li-hua2, SUN Chang-sen3
（1. College of Biological and Environmental Sciences, Zhejiang Wanli University, Ningbo 315100, China;2. Zhejiang Mari-culture Research Institute, Wenzhou 325005, China; 3. College of Life Sciences, Taizhou University, Linhai 317000, China）

S917.4

A

1000-3096（2010）12-0040-06

2010-03-24;

2010-07-15

浙江省科技廳面上農(nóng)業(yè)項(xiàng)目（2009C32020）; 浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（Y3090007）; 臺州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（08KY07）

董迎輝（1980-）, 男, 河南洛陽人, 博士生, 研究方向?yàn)楹Ｑ筘愵惏l(fā)育生物學(xué)和遺傳育種學(xué), E-mail: dongyinghui118@126.com; 林志華,通信作者, 博士, 研究員, 主要從事海洋經(jīng)濟(jì)貝類遺傳育種研究, E-mail:zhihua9988@126.com